[发明专利]一种纳米介孔材料固定靶蛋白筛选中药活性成分的方法

权利要求书

1.一种纳米介孔材料固定靶蛋白筛选中药活性成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤A：制备固定化靶蛋白：采用物理吸附法，将靶蛋白溶于的最适pH的缓冲液中，加入介孔材料，冰浴条件下搅拌孵育；

步骤B：制备固定化靶蛋白抑制剂筛选模型：以水为流动相，将步骤A所述固定化靶蛋白装入色谱柱中，构成固定化靶蛋白抑制剂筛选模型；

步骤C：验证步骤B制备的固定化靶蛋白抑制剂模型的有效果性；

首先，选择对靶蛋白具有代表性抑制作用的抑制剂；再将步骤B制备的固定化靶蛋白抑制剂模型连接液相色谱仪，将一定量的固定化靶蛋白抑制剂溶于与步骤A中所述缓冲液pH相同的缓冲液中作为第一流动相；

其次，开启液相色谱仪，用所述第一流动相平衡柱子，每隔固定时间进样靶蛋白的饱和浓度的底物固定次数，收集不同时刻出峰第一馏分；进样靶蛋白的饱和浓度的底物固定次数后，将所述的第一流动相换成不含固定化靶蛋白抑制剂的与步骤A中所述缓冲液pH相同的缓冲液，每隔固定时间进样靶蛋白的饱和浓度的底物固定次数，收集不同时刻出峰第二馏分；

最后，收集的不同时刻出峰第一馏分和不同时刻出峰第二馏分分别冷冻干燥，溶于水，用分析型色谱柱分离底物和产物，纪录不同时刻出峰第一馏分产物及不同时刻出峰第二馏分产物的峰面积。

步骤D：重复步骤A和步骤B的步骤，将步骤B制备的固定化靶酶抑制剂模型连接液相色谱仪，将与步骤A中所述缓冲液pH相同的缓冲液中作为第二流动相；开启液相色谱仪，用所述的第二流动相平衡柱子后，固定时间进样靶蛋白的饱和浓度的底物，收集不同时刻出峰第三馏分，所述出峰第三馏分冷冻干燥，溶于水，用色谱柱分离底物和产物，纪录不同时刻出峰第三馏分产物峰面积；

步骤E：固定化靶蛋白抑制剂的抑制曲线：以时间为横坐标，以靶蛋白的残余活力为纵坐标，制作随时间改变，靶蛋白经历活性被抑制或激活和活性恢复的过程曲线；所述残余活力为不同时刻出峰第一馏分产物峰面积或不同时刻出峰第二馏分产物峰面积与不同时刻出峰第三馏分产物峰面积之比；

步骤F：参照上述步骤A至步骤E中的方法，将方法中的靶蛋白抑制剂换成天然药物，筛选天然药物中活性成分，考察其对靶蛋白的抑制作用及抑制类型。

2.根据权利要求1所述一种纳米介孔材料固定靶蛋白筛选中药活性成分的方法，其特征在于，所述介孔材料为羧基或氨基修饰的有机介孔氧化硅材料。

3.根据权利要求2所述一种纳米介孔材料固定靶蛋白筛选中药活性成分的方法，其特征在于，所述羧基或氨基修饰的有机介孔氧化硅材料通过以下步骤制备：

步骤A：以三嵌段化合物聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯为模板剂，1,3,5-三甲基苯为扩孔剂，1,2-双-三乙氧基硅基乙烷为前导物，添加2-氰基丙基三乙氧基硅烷或氨丙基三甲氧基硅基乙烷的羧基或氨基偶联剂；

步骤A2：调节三嵌段化合物聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯和1,3,5-三甲基苯的比例，制备不同孔径的羧基或氨基修饰的有机介孔氧化硅材料。

4.根据权利要求3所述一种纳米介孔材料固定靶蛋白筛选中药活性成分的方法，其特征在于，所述三嵌段化合物聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯和1,3,5-三甲基苯的比例为4:0到4:4。

5.根据权利要求3所述一种纳米介孔材料固定靶蛋白筛选中药活性成分的方法，其特征在于，所述羧基或氨基修饰的有机介孔氧化硅材料的孔径为8～30nm。

6.根据权利要求1至5任一项所述一种纳米介孔材料固定靶蛋白筛选中药活性成分的方法，其特征在于，步骤A所述冰浴条件下搅拌孵育时间为7小时。

7.根据权利要求1至5任一项所述一种纳米介孔材料固定靶蛋白筛选中药活性成分的方法，其特征在于，步骤C所述第一流动相平衡柱子15分钟后，每隔固定时间为20或30分钟进样靶蛋白的饱和浓度的底物8至12次，收集出峰第一馏分。

8.根据权利要求1至5任一项所述一种纳米介孔材料固定靶蛋白筛选中药活性成分的方法，其特征在于，步骤C所述第一流动相换成不含固定化靶蛋白抑制剂的与步骤A中所述缓冲液pH相同的缓冲液，每隔固定时间为20或30分钟进样靶蛋白的饱和浓度的底物8至12次，收集出峰第二馏分。

9.根据权利要求8所述一种纳米介孔材料固定靶蛋白筛选中药活性成分的方法，其特征在于，步骤C所述固定时间进样的出峰第一馏分、出峰第二馏分及步骤D固定时间进样的出峰第三馏分分别冷冻干燥后溶于300ul的水溶液中，再用C18分析型色谱柱分离底物和产物。