[发明专利]一种目的蛋白制备方法及其用途

说明书

【技术领域】

本发明涉及基因工程技术，特别涉及一种目的蛋白制备方法及其用途。

【背景技术】

神经生长因子（NGF）是1951年是由诺贝尔生理学和医学奖获得者R.Levi-Montalcini和S.Cohen在小鼠肉瘤细胞内发现的[1,2]。NGF在神经元的发育、生长、分化以及轴突的生长、递质的合成及细胞的凋亡等阶段均起着重要作用。它促进发育中的交感、感觉神经元的分化和成熟。维持成年交感神经元的正常功能。经典的NGF是从小鼠颌下腺中分离所得的分子量为140000的糖蛋白，由α、β、γ三种肽链按α2βγ2的比例构成，在NGF三种亚基中，β亚单位是NGF的活性区，因而习惯上所谓的NGF就是指其β亚单位，由两个118个氨基酸组成的单链通过非共价键结合而成二聚体，与人体NGF的结构具有高度的同源性，生物效应也无明显的种间特异性[3,4]。

天然NGF蛋白主要是从成年雄性小鼠颌下腺分离和纯化而得的，方法包括，利用Varon等（1967,1972）的方法通过辅助修饰分离出7s NGF复合物；利用Smith等（1968）的方法分离出7s NGF中的β-NGF亚单位，即用0.05M，pH 10.3硼酸钠缓冲液（sodium borate buffer)（含有1.5M NaCl）从CM纤维柱（CM-cellulose column）上洗脱得到β-NGF；利用Bocchini和Angeletti（1969）的方法可制备2.5s NGF；利用Smith等（1968）的方法亦可获得7s NGF的α和γ亚单位，较为经典的是Mobley等（1976）的方法。

用基因工程方法表达和纯化人神经生长因子，近年来一直备受关注，有报道用昆虫、酵母细胞和大肠杆菌等表达系统表达NGF[5-8]。

目前，存在的主要问题是如何提高表达量、易于纯化和保持良好的生物学活性。目前需要一种解决以上问题的蛋白制备方法。

【发明内容】

本发明要解决的技术问题是：提供一种提高表达量、易于纯化和保持良好的生物学活性的蛋白制备方法。

为实现上述目的，本发明提供以下技术方案，包括以下步骤：

目的蛋白核苷酸序列片段的获得；

目的蛋白重组表达载体的构建；

目的蛋白的诱导表达；

目的蛋白的纯化；

纯化产物的切割；

所述目的蛋白的核苷酸序列片段的前面插入单体切割的识别位点；

所述目的蛋白通过PCR扩增得到，通过引物引入单体切割的识别位点；

优选的，目的蛋白是人神经生长因子，胸腺肽、虎纹克胰肽、虎纹镇痛肽。

在纯化之前还包括鉴定蛋白表达的步骤。

所述目的蛋白重组表达载体构建中的目的蛋白基因是一个或一个以上拷贝；

所述目的蛋白基因的一个以上拷贝数通过将含有一个以上拷贝目的蛋白基因的表达盒与表达载体构建来实现。

所述的单体切割的识别位点是根据密码子规则编码的氨基酸序列，优选地，切割位点序列编码为单个氨基酸或两个氨基酸或三个氨基酸或六个氨基酸；更优选地，所述单个氨基酸为R或W或M或D或E或K；两个氨基酸为D-P或N-G；三个氨基酸为R-K-R或R-R-R；六个氨基酸为L-V-P-R-G-S。所述的英文大写字母为氨基酸的代码，比如R表示精氨酸，W表示色氨酸，M表示甲硫氨酸，D表示天冬氨酸，E表示谷氨酸，P表示脯氨酸，N表示天冬酰氨,G表示苷氨酸,K表示赖氨酸,L表示亮氨酸,V表示缬氨酸,S表示丝氨酸。遵守20种氨基酸的密码子表。

所述的单体切割的识别位点可通过定点突变目的基因来实现；优选地将人神经生长因子的第158和第213位的甲硫氨酸突变为苏氨酸。

当所述目的蛋白基因是一个以上拷贝时，是以目的蛋白表达盒为单位进入表达载体进行克隆的；

优选地，当得到一个拷贝数的重组表达载体时，在此基础上经过酶切连接等手段重组得到两个拷贝数的重组表达载体；依次类推，得到一个以上拷贝数的各重组表达载体。每个单拷贝均含有完整的表达盒，其中包含目的基因、标签蛋白编码序列和各类表达元件的完整操纵子序列，确切的，标签蛋白编码序列包括但不限于6×His或GST蛋白或MBP蛋白编码序列，表达元件包括启动子、操纵子、核糖体结合位点、多克隆位点和转录终止信号，并且，采用该方法构建β-hNGF串联多拷贝时，具有定向连接特征。