[发明专利]一种检测铬生物可利用度的微生物细胞传感器

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测水体及土壤中铬生物可利用度的微生物细胞传感器的搭建及使用。

背景技术

铬(Cr)是人体必需的微量元素，在冶金、电镀、制革和化学品制造等行业被广泛应用。Cr³⁺是对人体有益的元素，而Cr⁶⁺是有毒的。铬污染主要是由于在铬矿、铬制品的生产过程中对铬废水和铬渣的不合理处理造成的。在土壤中，铬以Cr³⁺和Cr⁶⁺这两种形态存在，Cr⁶⁺以阴离子的形态存在，不易被土壤吸附，有较强的移动性，易对植物产生毒性，进而通过农产品进入人体直接危害人体健康，而Cr³⁺极易被土壤胶体吸附以及形成沉淀，移动性差，毒性较低。Cr⁶⁺对人主要是慢性毒害，它可以通过消化道、呼吸道、皮肤和粘膜侵入人体，在体内主要积聚在肝、肾和内分泌腺中。通过呼吸道进入的则易积存在肺部，通过强氧化作用产生毒性。由于Cr⁶⁺毒性较强，直接决定着Cr的毒性大小，对污染环境中Cr⁶⁺进行准确、合理地检测及评价是进行Cr污染风险评价及修复的前提。

目前监测和检测重金属污染物主要有两种方法：一种是物理化学分析法，如电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)、电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)等，其优点是具备高检测灵敏度和高特异性，但也存在一些不足，如仪器设备昂贵，操作复杂，检测周期长，最重要的一点是，传统的物理化学方法主要是对环境重金属总量进行测定，不能检测重金属的生物可利用度；另一种方法是基于生物有机体的生物传感器，其优势是可以直接反映污染物对生物有机体的毒性及影响。微生物细胞具有易操作，繁殖及生存能力强，易储存和稳定性高的特点，以微生物细胞为生物学感应元件的微生物细胞传感器可以极大简化传感器的制作过程，提高传感器的检测效率。

微生物细胞传感器的微生物细胞含有一个由特异调控蛋白基因和报告基因组成的重组质粒。当宿主细胞的生长环境中有重金属离子存在时，宿主细胞通过不同的机制吸收重金属离子。当重金属离子进入到胞内后，重组质粒或宿主染色体DNA编码的转录调控蛋白被重金属离子特异激活，与启动子绑定或从启动子上脱落，激活(“turn on”)或抑制(“turn off”)启动子的启动，进而调控下游报告基因表达，产生可检测的信号，这种信号的变化强度与重金属诱导物的浓度密切相关，转录调控蛋白对重金属离子的识别能力和绑定能力决定着微生物全细胞传感器的检测特异性和灵敏度。微生物细胞传感器已成为重金属生物可利用度监测和风险污染评价的重要工具。

发明内容

本发明的目的在于针对现有的化学检测方法不能反映铬的生物可利用度且存在操作复杂、仪器价格昂贵等问题，利用Cmetallidurans CH34菌株的pMOL28质粒铬抗性操纵子chr的启动子序列、调控蛋白基因chrB和商业化质粒pEGMluc的荧光素酶报告基因(luc)，构建了一种微生物细胞传感器，从而提供了一种具有高灵敏度、低成本等特点的铬生物可利用度检测方法。

构建该细胞传感器的具体操作步骤为：

1、T7启动子和报告基因的拼接

以商业化质粒载体pRSET A.B.C为模板，PCR扩增得到T7启动子片段f1；以商业化质粒载体pGEM-luc为模板，PCR扩增得到荧光素酶报告基因luc片段f2；将片段f1和f2按一定比例混合，以混合液为模板，PCR扩增得到T7启动子和报告基因luc的拼接片段f3；

2、包含T7启动子的报告基因导入pUC18质粒：

对pUC18质粒用SacI与BamHI进行双酶切处理，纯化后得到载体v1；对拼接序列f3用SacI与BamHI进行双酶切处理，纯化后得到片段f4；将片段f4连入载体v1，利用大肠杆菌E.coli作为宿主进行转化，得到含有T7启动子和报告基因luc的载体v2；

3、载体v2中lac启动子的去除：

以pUC18为模板，扩增得到不含lac启动子的pUC18部分序列f5；对f5用SacI和HindIII进行双酶切处理后纯化得到片段f5′；对载体v2用SacI和HindIII进行双酶切处理，纯化后得到载体v3；将片段f5′连入载体v3，利用大肠杆菌作为宿主进行转化，得到含有T7启动子和报告基因luc且去除lac启动子的载体v4；

4、载体v4与T7终止子的拼接：