[发明专利]一种目的蛋白制备方法及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术，特别涉及一种目的蛋白制备方法及其用途。

背景技术

随着基因工程技术的发展，一些具有生物活性的小分子多肽如胸腺肽等受到高度重视。胸腺肽是由胸腺产生的一种蛋白质和多肽激素。早在20世纪60年代，Miller等人（Lancet, 1961, 2:748－749.）就发现胸腺肽对免疫系统有重要作用，并从中分离到一组分子量为1000－15000D的多肽混合物，称为胸腺肽组分5（thymosin fraction 5, TF5）；随后Goldstein等人（Proc. Natl. Acad. Sci. USA ,1966,56: 1010–1017）从牛胸腺抽提物的TF5分离出一种酸性多肽α1组分（thymosin α1，Tα1），Tα1是TF5的主要活性组分，在哺乳动物中异常保守，广泛分布于哺乳动物的胸腺、脾、肺、肾、脑、血液和其他组织中，在胸腺中浓度最高。

目前，活性多肽的制备多数采用化学合成或生物组织提取的方法，作为活性多肽的胸腺肽也不例外。临床上广泛应用的用各种改良方法制备的胸腺肽类制剂大多是从动物组织中提取的多种肽类的混合物，不同公司生产的胸腺肽类制剂的活性相差甚远，而有的因生产工艺或质量问题使产品中含有牛或猪等蛋白，注射时可产生过敏反应。因此，有人采用人胚胎胸腺作为原料，制备出人胸腺肽α1组分（thymosin α1，Tα1），疗效不错。但由于人胚胎来源困难，价格昂贵，而且Tα1含量很少。随着人类基因组计划的不断实施，胸腺肽的氨基酸序列顺序可以轻易获得，使化学合成类似胸腺肽的活性多肽成为可能。国内外多个研究组，比如Wang S S等、黄臻辉、苷一如等、程虎等（Int J Pept Res,1992,40(3－4):344；药物生物技术, 2001, 8(4):207；化工学报, 2004, 55(2):305；南京工业大学学报(自然科学版), 2004, 26(2):78）采用不同的固相方法以及适宜的技术进行了Tα1的合成和工艺优化，但是化学合成工艺始终解决不了成本高、产量低、纯度差与活性低的难题。

为了获得质量高、疗效好的胸腺肽类制剂，科学家开始探索应用基因工程方法制备胸腺肽，并引起了针对Tα1的广泛研究^[1,2,7]。与化学合成方法或组织提取方法相比，基因工程方法用于生产Tα1制品在降低成本、提高产量、减少毒性副产物或恢复生物活性方面具有一定的优势和改良，但是，由于融合表达使目的肽在融合蛋白中所占比例小，造成宿主表达潜能浪费，而减小标签蛋白长度又降低融合蛋白稳定性。因此，无论是单独表达或是与标签蛋白形成融合改善细胞毒性作用的表达方式，都不能从根本上解决产量问题，难以作为大规模生产的工艺技术进一步推广。

上述单拷贝或融合表达所存在的问题，可将多肽基因进行串联表达而得以解决：（1）串联增加了多肽基因数量，有利于提高表达量；（2）串联多聚体形式的表达可有效屏蔽宿主毒性；（3）多聚体表达产物更稳定。因此，对Tα1多肽采用构建多聚体的方法对于提高表达量具有突出的优势。

迄今，多种肽的多聚体、多拷贝形式已获得成功表达^[8-11]。国内仅有少数的两篇报道中提及Tα1的定向多拷贝克隆制备方案，其一采用基因片段随机退火和PCR技术相结合的方法构建了3个拷贝的Tα1串联构建体^[28]；其二采用表达盒串联法构建了含有1－8个拷贝Tα1完整表达盒的构建体^[29]。在第一种方法中，传统的PCR方法虽然简便易行，但是作者未考虑到串联构建体表达之后的单体切割问题，仅单纯从技术方法探讨了该方法的可行性。第二种方法虽然可以获得比较高拷贝的串联构建体，各表达盒独立表达多肽产物而规避了后续的多肽切割步骤，但是Tα1单体表达产物分子量太小，容易被降解而难以实现表达量的提升。

因此，目前需要一种构建高效表达胸腺肽制品的基因工程方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种高效表达目的蛋白的基因工程方法。

为实现上述目的，本发明提供以下技术方案，包括以下步骤：

目的蛋白的核苷酸序列片段的获得；

目的蛋白重组表达载体的构建；

目的蛋白的诱导表达；

目的蛋白的纯化；

纯化产物的切割；

所述目的蛋白的核苷酸序列片段的下游引入单一切割位点；

所述目的蛋白通过合成编码链和模板链，将两者杂交获得，在合成编码链和模板链时引入单体切割的识别位点；