[发明专利]3-甲硫酪氨酸翻译系统及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物化学领域。具体地，本发明提供氨酰基-tRNA合成酶突变体，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列和SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的保守性变体组成的组，所述保守性变体具有与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列相同的酶活性。本发明还涉及一种2-氨基-3-(4-羟基-3-(甲硫)苯基)丙酸(简称3-甲硫酪氨酸，简写为MtTyr)翻译系统。更具体地，本发明涉及利用正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶的配对将3-甲硫酪氨酸定点特异性插入目标蛋白质的3-甲硫酪氨酸翻译系统，和利用所述翻译系统在目标蛋白质中定点特异性插入3-甲硫酪氨酸的方法。本发明还涉及用这套翻译系统和这种方法产生的含有3-甲硫酪氨酸的突变蛋白质，例如，插入3-甲硫酪氨酸的肌红蛋白突变体，以及插入3-甲硫酪氨酸的突变蛋白质的应用。

背景技术

蛋白质是所有生命体及其生命活动的主要物质基础。在整个蛋白中，约有三分之一的蛋白都是一些含金属的蛋白，称为金属蛋白(Metalloprotein)或金属酶(Metalloenzyme)。金属酶中普遍存在通过硫醚键结合的Tyr-Cys辅助因子，例如：半乳糖氧化酶(GO)，乙二醛氧化酶，半胱氨酸双加氧酶(CDO)，亚硫酸盐还原酶(NirA)以及Thioalkalivibrio nitratireducens细胞色素c亚硝酸盐还原酶(TvNiR)。在上述的所有酶中，酪氨酸苯环上的C3原子与邻近半胱氨酸的S原子均能自发地形成共价键，而不需要任何外源性蛋白质催化。因此，这种Tyr-Cys辅助因子的基本功能目前已被多位合成化学家、物理化学家、酶学家和结构生物学家深入研究，并且取得了巨大的突破。尽管如此，关于该辅助因子在酶催化过程中的确切作用至今仍无人知晓，而限制其研究的瓶颈问题是无法通过传统的定点诱变方法来探测这种翻译后修饰的结构。为了克服这种限制，有人合成出模拟Tyr-Cys共价交联的化合物来进行研究。结果表明，Tyr-Cys共价交联基团可以显著降低苯环侧链的pKa值和还原电位，因此促进了酶作用底物和Tyr-Cys辅助因子之间的质子耦合电子转移，而这对优化酶活性是至关重要的因素。

本发明拟通过在肌红蛋白中定点特异性插入3-甲硫酪氨酸，使其模拟Thioalkalivibrio nitratireducens细胞色素c亚硝酸盐还原酶(TvNiR)活性中心的Tyr-Cys辅助因子，该研究将为金属酶中Tyr-Cys辅助因子的催化机制提供研究基础。本研究现已开发了在原核和真核生物中将各种非天然氨基酸体内位点特异性地定点插入蛋白质的通用方法。这些方法依赖于正交蛋白质翻译组分，所述组分识别合适的选择密码子(selector codon)从而能在体内多肽翻译期间将所需的非天然氨基酸插入限定位置。这些方法利用识别选择密码子的正交tRNA(O-tRNA)，而相应的特异性正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)用非天然氨基酸加载该O-tRNA。这些组分不与宿主生物体内的任何内源性tRNA、氨酰基-tRNA合成酶(RS)、氨基酸或密码子交叉反应(即，它必须是正交的)。利用这种正交tRNA-RS配对可能遗传编码大量结构各异的非天然氨基酸。