[发明专利]3-甲硫酪氨酸翻译系统及其应用

权利要求书

1.一种正交氨酰基-tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列选自由SEQID NO：4所示氨基酸序列和SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的保守性变体组成的组，所述保守性变体具有与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列相同的酶活性，所述正交氨酰基-tRNA合成酶命名为正交3-甲硫酪氨酸氨酰基-tRNA合成酶。

2.一种3-甲硫酪氨酸翻译系统，所述系统包含：

(i)3-甲硫酪氨酸；

(ii)权利要求1所述的正交氨酰基-tRNA合成酶；

(iii)正交tRNA，其包含SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述3-甲硫酪氨酸优先氨酰化所述正交tRNA；和

(iv)编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子。

3.如权利要求2所述的翻译系统，其特征在于，所述正交tRNA是琥珀抑制型tRNA，所述选择密码子是琥珀密码子，并且所述翻译系统还包含编码正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列。

4.一种宿主细胞，其包含编码权利要求1所述的正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列和相对应的正交tRNA序列。

5.如权利要求4所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真细菌细胞，优选大肠杆菌细胞。

6.一种产生在至少一个所选位置定点特异性插入3-甲硫酪氨酸的突变蛋白质的方法，所述方法包括下述步骤：

(a)提供权利要求2所述的3-甲硫酪氨酸翻译系统，该系统包含：

(i)3-甲硫酪氨酸；

(ii)权利要求1所述的正交氨酰基-tRNA合成酶；

(iii)正交tRNA，其包含SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述3-甲硫酪氨酸优先氨酰化所述正交tRNA；和

(iv)编码所述目标蛋白质的核酸，其中所述核酸在所选的位置包含所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子；和

(b)将所述正交tRNA序列和编码所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列以及编码所述目标蛋白质的核酸序列克隆并转化到适当的宿主细胞中，在培养基中加入3-甲硫酪氨酸，在所述目标蛋白质的翻译期间，3-甲硫酪氨酸氨酰化的正交tRNA识别编码所述目标蛋白质的mRNA上的选择密码子以及3-甲硫酪氨酸，从而介导3-甲硫酪氨酸定点特异性插入所述选择密码子对应的氨基酸位置，从而产生在所选位置含3-甲硫酪氨酸的所述目标蛋白质。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述正交tRNA是琥珀抑制型tRNA，并且所述选择密码子是琥珀密码子。

8.生产含有3-甲硫酪氨酸的肌红蛋白突变体的方法，其利用权利要求6所述的方法，其中所用的编码肌红蛋白突变体的核酸序列在适当的位置包含所述正交tRNA特异性识别的选择密码子，在肌红蛋白的翻译期间，3-甲硫酪氨酸定点插入到所述选择密码子对应的氨基酸位置，从而产生含有3-甲硫酪氨酸的肌红蛋白突变体。

9.由权利要求8所述的方法获得的含有3-甲硫酪氨酸的肌红蛋白突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO：6，所述肌红蛋白突变体具有亚硝酸盐还原酶活性。

10.一种酪氨酸酚裂解酶突变体，所述酪氨酸酚裂解酶突变体催化2-羟基苯硫醚生成3-甲硫酪氨酸，其氨基酸序列为：

(1)SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，或

(2)将SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列相同的催化2-羟基苯硫醚生成3-甲硫酪氨酸的酶活性的由SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。