[发明专利]一种凝结芽孢杆菌及其高密度发酵的工艺

说明书

技术领域

本发明属于发酵工程技术领域，涉及一种凝结芽孢杆菌及其反馈补料发酵实现高密度培养的生产工艺。 

背景技术

凝结芽孢杆菌在自然界分布广泛，其芽孢对热及其他致死因子有较强的抵抗能力，对抗菌素及其他化学药品的抗性也高。正是由于这个特性再加上有益凝结芽孢杆菌具有分泌各种蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、超氧化物歧化酶（SOD）、抗菌素及多种氨基酸、维生素等营养物质的能力，因此可以被广泛应用于医药保健、农业和食品等各领域。 

凝结芽孢杆菌是芽孢杆菌中极具应用潜力的菌种之一，其抑菌效果显著。该菌主要特征与普通乳酸菌十分相似，口服后可在盲肠、结肠内定植，在大肠中进行发酵，且在发酵过程中，可产生短链脂肪酸，如乳酸和醋酸等；凝结芽孢杆菌是兼性厌氧菌，能适应低氧的肠道环境，进入肠道后会消耗游离氧并繁殖，有利于厌氧微生物乳酸菌和双歧杆菌的生长；该菌对酸和胆汁有高耐性，能够进行乳酸发酵，产生的L～乳酸能降低肠道pH值，抑制有害菌；由于能够形成芽孢，所以较之不产乳酸的芽孢杆菌更益于恢复胃肠道微生态平衡。从而促进肠道微生态平衡，提高机体免疫和抗病能力，预防肠道疾病。凝结芽孢杆菌对多种植物病原菌有很强的抑制作用，也可作为农业增产物质使用。Bacillus coagulans CGMCC No.6681经田间抑菌及生防试验还发现其对瓜、果、蔬菜等经济作物的灰霉病、纹枯病、白粉病、黑斑病等多种作物病害都具有显著的防治效果。 

在生物技术产业化平台中，细胞大规模培养等中下游技术是我国最薄弱的技术环节，本发明针对凝结芽孢杆菌产业化过程中遇到的瓶颈问题进行深入研究，并对细胞大规模培养的工业化发酵工艺进行探索，以降低凝结芽孢杆菌的生产成本，为生物农药的大规模生产、推广提供可借鉴模板。 

发明内容

本发明的目的在于提高凝结芽孢杆菌发酵单位及生产产量，为益生菌的大规模生产、推广而提供了一种凝结芽孢杆菌及其高密度发酵工艺；主要是通过反馈补料发酵方法来实现高密度发酵。 

本发明的技术方案为：一种芽孢杆菌，其分类命名为凝结芽孢杆菌菌株，菌种的拉丁学名是：Bacillus coagulans，参据的菌株为：NJYHHWG 877005，保 藏日期是2012年10月18日，保藏中心登记入册编号是CGMCC No.6681。 

本发明还提供了一种利用上述凝结芽孢杆菌进行高密度发酵的工艺，其具体步骤如下：从营养琼脂培养基挑取凝结芽孢杆菌菌体，接入种子液培养基摇瓶培养得发酵种子液；取发酵培养基体积的4～20%的发酵种子液接入灭菌后装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养；通过反馈补料法控制营养物质的浓度进行高密度发酵，控制温度、通气量和转速，发酵培养48～78h得发酵液。 

上述的培养发酵种子液是从35～42℃培养50～72h后的营养琼脂培养基上挑取菌体，接入装有种子液培养基的无菌锥形瓶中，35～42℃条件下摇床培养，控制转速140～200rpm，32～48h后得发酵种子液；其中锥形瓶中装的种子液培养基量为锥形瓶体积的5～25%。 

优选所述的种子液培养基组分为：蛋白胨8～15g/L，酵母膏3～8g/L，NaCl4～8g/L，葡萄糖35～70g/L，pH控制在6.5～7.8。 

优选发酵培养基组分：蛋白胨8～15g/L，酵母膏3～8g/L，NaCl 4～8g/L，葡萄糖35～70g/L，CaCO₃ 10～15g/L，K₂HPO₄ 0.8～1.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1～0.6g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.005～0.015g/L，MnCl₂·4H₂O 0.001～0.005g/L，pH保持在6.5～7.8；发酵罐装液量为发酵罐体积的20～45%。