[发明专利]一种利用MeJA和SA提高白桦细胞中白桦酯醇和齐墩果酸含量的方法

说明书

所属技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种利用MeJA和SA提高白桦细胞中白桦酯醇和齐墩果酸的方法。 

背景技术

白桦树皮中具有重要的三萜类物质，其中白桦酯醇和齐墩果酸具有抑制多种肿瘤和艾滋病毒的功效，因天然、高效、低毒，被誉为是优良的、极具开发潜力的抗艾滋病和肿瘤的先锋药物。然而，树木生长周期长，若获得白桦酯醇需对树木进行砍伐或扒皮，破坏资源，加之其结构复杂，人工方法合成效率低，成本高等因素而成为制约其不能进行临床大规模应用的主要原因。以细胞全能性为基础建立起来的植物细胞培养技术为植物药生产提供了一条新途径。由于利用植物细胞培养法生产植物天然活性物质具有不受气候、病虫害等自然条件的影响,而且不占用土地,不消耗自然资源,生产周期短和人为可控等优点，因而被认为是解决植物药生产与天然植物资源可持续发展之间矛盾的一种新型生物技术。茉莉酸甲酯(methyl-jasmonate,简称MeJA)和水杨酸(salicyl acid,SA)是植物体内普遍存在的小分子化合物，已被证明是植物种间和种内化学通讯物质,是系统获得性抗性(Systemic Acquired Resistance,SAR)的重要诱导因子,也是植物受病原菌侵染后活化一系列防卫反应的信号传导途径中的重要组成成分，来源于植物内部的内源性诱导子SA和MeJA不仅对植物抗逆、抗病虫和微生物侵染，诱导植物防御系统产生植保素，而且也是介导外源真菌诱导子促进植物细胞次生代谢产物合成的重要信号分子，对多种次生代谢产物的合成具有诱导作用,被认为是非常有效的诱导子。研究证明，对细胞培养中多种次生代谢产物紫杉醇、喜树碱、异黄酮、甘草皂苷、葛根素等的合成及其相应产物关键酶基因具有积极的诱导和促进作用。另有研究发现:外源MeJA能诱导水稻叶片中抗菌物质、化感物质萜类的合成，同时促进云杉、松树和椰子等单萜、二萜、多萜类树酯的合成，以抵抗病原菌侵染和虫咬，并能提高西红柿和樱桃抗逆物质积累，延长保险期。而关于MeJA和SA对白桦愈伤组织和悬浮培养细胞中次生产物的诱导合成研究未见报道。 

发明内容：

为保护白桦自然资源，建立可持续开发利用的资源生产程序，利用来自白桦无菌苗诱导的愈伤组织和悬浮培养细胞，进行MeJA和SA的诱导处理，提高白桦酯醇和齐墩果酸的合成量。为进行工业化法大规模生产白桦酯醇和齐墩果酸类药物的提供了新方法。 

技术方案是：获得7～8年生白桦原生植株休眠芽、展叶芽以及种子作为诱导组培苗的外植体，经表面消毒，接种于WPM+1.0mg/L 6-BA培养基进行白桦组培苗的诱导及继代培养，取生长30天左右的组培苗，将茎段和叶片切成1cm左右,接种于白桦愈伤组织诱导培养基，NT为基本培养基，附加激素0.1mg/L 6-BA和0.01mg/LTDZ，进行白桦愈伤组织诱导，选择细胞生长速度快，松散且总三萜物质含量高的愈伤组织，进行多次继代和悬浮培养。悬浮继代20次以上，获得高产白桦酯醇和齐墩果酸悬浮细胞。在含100mL的液体培养基中加入3g白桦细胞，震荡培养，在悬浮培养第七天分别添加100uM/L MeJA和50mg/L SA,此后24h 48h收获，经过滤，烘干，粉碎，有机溶剂提取步骤，利用液相色谱方法对白桦酯醇和齐墩果酸检测和定量分析。 

本专利具有一下特点： 

1）生产环境不受地域、季节、水质、病虫害、气候等自然环境的影响。 

2）生产周期短，生产过程不产生大量废渣废水，安全无污染，具有生态效益。 

3）利用低剂量MeJA和SA促进白桦悬浮细胞中白桦酯醇和齐墩果酸的高效积累，降低成本，且有利于实现白桦天然植物资源及其药用成分的开发利用。 

具体实施方式

1）植物材料来源 

白桦母树取自东北林业大学白桦强化种子园，7-8年生嫁接优树（接穗30年生）休眠芽、种子作为诱导组培苗的外植体诱导（WPM+1.0mg/L 6-BA培养基）白桦组培苗。以白桦组培苗茎段为外植体，NT为基本培养基，附加激素0.1mg/L6-BA和0.01mg/LTDZ，诱导愈伤组织，挑选生长状态良好的愈伤组织将其多次继代后转移至液体培养基悬浮培养。经过20代以上的转接，建立稳定的悬浮培养细胞体系，悬浮培养继代周期为15d，接种量为3g细胞于100mL液体培养基中。 

2）培养条件