[发明专利]建立李属坏死环斑病毒的逆转录环介导等温扩增检测方法

说明书

发明领域

本发明属于生物技术病毒检测技术领域，具体的说，本发明具体涉及一种环介导等温扩增(LAMP)技术检测李属坏死环斑病毒(PNRSV)的技术领域。 

背景技术

目前对病毒核酸的分子检测多采用基于PCR反应的各类技术，如常规PCR、巢式PCR、实时荧光PCR等，不仅需要PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪等昂贵的仪器设备，且操作程序繁琐复杂、时间长，对检测人员较高的技术要求，大大限制了作为快速诊断方法的使用和推广。 

环介导等温扩增(LAMP)是Notomi等在2000年开发的一种恒温核酸扩增方法，具有特异性强、操作简单、不需要复杂的仪器，肉眼可直接观察检测结果，其高效性、简易性、成本低廉且检测周期短等特点非常适合于基层及现场使用；该技术针对目的基因的6个区段，设计4条特异引物并利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在一定温度下对核酸进行等温扩增；最近几年已开始应用于生物致病病原的检测。此前，已有应用在肺炎链球菌、西尼罗病毒、SARS病毒、番茄黄叶病毒、山药嵌纹病毒、肺炎支原体等病原微生物的检测以及登革病毒的分型等方面的报道，日前，尚未见利用LAMP技术检测李属坏死环斑病毒的报道。 

李属坏死环斑病毒(PNRSV)是《中华人民共和国进境植物检疫危险性病、虫、杂草名录》中二类危险性检疫对象，也是世界上许多国家进口的检疫对象。PNRSV属于雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)等轴不稳环斑病毒属(Ilarvirus)，粒体形态为等轴对称多面体，直径约为22-23nm，有三种大小的粒子。PNRSV是 正单链的RNA病毒，核酸大小为8.056kb，为三分体线形。PNRSV通过种子及苗木等无性繁殖材料进行远距离传播，还可以经花粉、虫媒、嫁接、机械接种等迅速传播蔓延。PNRSV可侵染扁桃、樱桃、桃、李、杏等多种果树和西(甜)瓜、棉花、向日葵、菜豆、啤酒花等21个科、47个属189种植物，具有寄主范围广泛、侵染传播力强、危害严重、检疫和防控难度大等特点。果树一经感染便终生带毒、逐年加重、持久危害，引起叶片坏死环斑和穿孔，果实畸形，品质下降，腐烂加快，树体急剧衰退，提早枯死，一般可造成30％～70％的产量损失，严重的可导致树皮坏死、癌肿直至整株绝产、枯死，为果树生产中的一种毁灭性病害。目前该病害的发生已遍及欧洲、亚洲、非洲、南美和北美洲及大洋洲的40多个温带国家和地区。在中国PNRSV目前还仅限于个别地区发生。 

发明内容

目前针对现有技术中未见专门针对环介导等温扩增(LAMP)技术检测李属坏死环斑病毒的技术现状，本发明旨在提供一种建立李属坏死环斑病毒的逆转录环介导等温扩增检测方法，进行快速、特异、灵敏、简便的现场检测，克服已有技术的不足。 

本发明通过以下技术方案实现的：本发明根据PNRSV分离物CP基因的保守序列，设计了PNRSV RT-LAMP特异性引物，确定反应条件和试剂浓度并进行优化，建立了PNRSV的RT-LAMP快速检测体系，此方法对PNRSV的检测特异性强，2h即可获得检测结果，具有快速、高效、简易的特点。 

本发明提供了一种建立李属坏死环斑病毒的逆转录环介导等温扩增检测方法，包括以下步骤： 

(1)提供一套用于检测李属坏死环斑病毒的LAMP反应特异性引物序列，具体的寡聚核苷酸序列为： 

F3：AATCATACCCACGCTGGTG 

B3：AATTCGGGGAGGCACATTC 

FIP：TTCGCAGCCCTTTGTTGAGCC-TTGCAAGAAGTGCCATCCG 

BIP：TAGGGTTTCGAGCGGTGTAGGA-TCACGGTCCAAGTGGTCT 

(2)提供李属坏死环斑病毒的LAMP检测方法，即首先从待检测样品中制备反应模板，并配制LAMP反应体系，然后通过LAMP反应程序对反应模板进行扩增。 

(3)最后根据反应混合物的浊度对检测结果进行判断。 

本发明具体提供了一种建立李属坏死环斑病毒的逆转录环介导等温扩增检测方法，包括以下步骤： 

(1)设计用于检测李属坏死环斑病毒的的LAMP引物：根据现有技术报道及GenBank中公布的PNRSV分离物的CP基因保守序列，利用LAMP引物设计软件Primer Explorer V4设计1套特异性引物，包括1对外引物和1对内引物，引物序列如下(5′-3′)： 

F3：AATCATACCCACGCTGGTG