[发明专利]建立李属坏死环斑病毒的逆转录环介导等温扩增检测方法

权利要求书

1.一种建立李属坏死环斑病毒的逆转录环介导等温扩增检测方法，其特征在于，具体检测方法步骤如下：

(1)设计用于检测李属坏死环斑病毒的的LAMP引物：根据现有技术报道及GenBank中公布的PNRSV分离物的CP基因序列的CP基因保守序列，利用LAMP引物设计软件Primer Explorer V4设计1套特异性引物，包括1对外引物和1对内引物，引物序列如下(5′-3′)：

F3：AATCATACCCACGCTGGTG

B3：AATTCGGGGAGGCACATTC

FIP：TTCGCAGCCCTTTGTTGAGCC-TTGCAAGAAGTGCCATCCG

BIP：TAGGGTTTCGAGCGGTGTAGGA-TCACGGTCCAAGTGGTCT；

(2)植物总RNA的提取：取0.1g新鲜植物叶片或幼嫩枝条在液氮中研磨至粉末，采用RNAplant plus Reagen试剂盒提取样品总RNA，通过抽提RNA产物加入DEPC-ddH₂O溶解，-70℃保存备用；

(3)逆转录：以提取的植物总RNA为模板，建立反转录体系，反转录合成cDNA序列，20μL的反转录体系；

(4)配制LAMP反应体系：反应体系为27uL，各组分的用量为：10×Buffer缓冲液2.5uL；

(5)通过LAMP反应程序对反应模板进行扩增；

(6)通过上述步骤扩增结束后肉眼观察反应管浊度的变化，进行LAMP扩增产物的检测。

2.如权利要求1所述的建立李属坏死环斑病毒的逆转录环介导等温扩增检测方法，其特征在于，所述的反转录体系为RNA模板2μL，10mmol/L的dNTP 1μL，50μmol/L的OligodT 1μL，DEPC-ddH₂O 10μL，65℃下处理5min，冰上放置5min，加入5×first-strand Buffer 4μL，200U/μL的M-MLV反转录酶1μL，40U/μL的RNA酶抑制剂1μL；反应条件在30℃放置10min，42℃保温1h，再于95℃反应5min。

3.如权利要求1所述的建立李属坏死环斑病毒的逆转录环介导等温扩增检测方法，其特征在于，所述的LAMP反应体系为，反转录产物cDNA 5.0uL，2.5mmol/L的dNTP6.0uL，10μmol/L的引物F3、B3各0.5uL，10μmol/L的引物FIP、BIP各4.0uL，100μmol/L的Betain5.0uL，100mmol/L的MgSO₄1.5uL，8U/μL的Bst DNA聚合酶1.0uL，同时设置阴性对照。

4.如权利要求1所述的建立李属坏死环斑病毒的逆转录环介导等温扩增检测方法，其特征在于，所述的LAMP反应程序：95℃加热5min；冰上急冷3min，再加1.0μL Bst DNA聚合酶，65℃水浴反应1.5h，80℃灭活2min。

5.如权利要求1所述的建立李属坏死环斑病毒的逆转录环介导等温扩增检测方法，其特征在于，所述的根据反应混合物品示的反应管浊度的变化对检测结果进行判断，通过扩增结束后肉眼观察反应管浊度的变化；将扩增产物高速离心后观察管底有无焦磷酸镁白色沉淀，如出现白色沉淀即判断检测结果为阳性，即样品中感染有李属坏死环斑病毒，反之则为阴性。