[发明专利]Ⅱ型登革病毒KMB17细胞适应株及其制备方法

说明书

 

技术领域

本发明涉及一种病毒株的制备方法，尤其是Ⅱ型登革病毒在KMB17细胞上的适应株的分离、筛选、选育、纯化以及培养方法，属于病毒疫苗技术领域。

背景技术

登革病毒是以埃及伊蚊和白纹伊蚊等进行传播的虫媒病毒，广泛流行于世界100多个热带和亚热带国家及地区，能引起登革热、登革出血热及更为严重的登革出血休克征。依抗原性不同可将登革病毒分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四个血清型，其中Ⅱ型传播最广泛。近年来，由于全球气候变暖、人口流动频繁等因素，登革热在全世界的发病率提高了近30倍。在过去两年中全球登革热感染人群的数量持续增长，在东南亚中部和南部地区、美国以及南太平洋地区，每年约8000万人感染登革病毒，估计24000人死亡，超过100个国家的30亿人受到威胁。登革热是过去50年间世界上最为严重的传染病之一，已经成为严重的全球公共卫生问题。登革热不仅严重危害人民的健康，而且还为国家和个人带来严重的经济负担。由于还没有可供使用的登革热疫苗用于预防，登革热的防控形式日趋严峻，因此登革热疫苗相关的应用基础研究是一项迫在眉睫的任务。

现有的灭活和减毒活疫苗，主要以Vero、PDK、PGMK和FrhL等非人源性细胞为基质进行生产的，其残余DNA存在潜在的致病危险。普遍认为比较安全且免疫效果好的，仍然是用人源性细胞基质（如KMB17细胞）生产的疫苗，但已知的人源性登革病毒宿主细胞非常局限，能用于疫苗生产的还未发现。

人胚肺二倍体细胞KMB17用于人用疫苗具有很多优点: 无致癌性，且安全性高于其它细胞，易于规模化生产，而且对多种病毒具有广泛的敏感性， 用其制备病毒性疫苗，还可克服使用原代细胞时在其培养物中可能存在的各种潜在致病因子的危险，作为人源性细胞基质生产人用疫苗时，引入的外源因子较少，比动物来源的细胞基质具有更好的安全性，是当前病毒性疫苗生产较为理想的细胞基质，且能稳定实现大规模疫苗生产。人胚肺二倍体细胞KMB17，已经成功应用于甲肝疫苗、脊髓灰质炎疫苗的生产，其安全性和细胞稳定性都得到了广泛验证，但目前还没有成功应用于Ⅱ型登革病毒中国株的报导。

发明内容

本发明的目的在于提供一种Ⅱ型登革病毒KMB17细胞适应株及其制备方法，为将人胚肺二倍体细胞KMB17应用于Ⅱ型登革病毒疫苗的生产提供技术支持。

本发明提供的Ⅱ型登革病毒KMB17细胞适应株通过下列步骤获得：

1）、按1ml病毒液/瓶的量，将浓度为4.0MOI的Ⅱ型登革病毒液接种到生长致密，透明度好的白纹伊蚊细胞C6/36上，于温度为28+2℃、CO₂体积浓度为5%（v/v）的环境中，恒温吸附1小时，于相同环境中，按1:9的体积比，补加下列病毒维持液：RPMI-1640培养基 + 2%体积比(v/v）的小牛血清 + 2%体积比(v/v）的质量浓度为6.6%（w/v）的碳酸氢钠溶液，培养至第5天，于相同环境中，按2%体积比补加质量浓度为6.6%(w/v)的碳酸氢钠溶液，培养至第8～9天，当白纹伊蚊细胞C6/36病变CPE达++++时，收集细胞液，于4℃，3500×g离心分离5min，收获上清，即得病毒液；

2）、将步骤1所得病毒液，按1ml病毒液/瓶的量,接种到生长致密，透明度好的白纹伊蚊细胞C6/36上，于温度为28+2℃、CO₂体积浓度为5%（v/v）的环境中，恒温吸附1小时，于相同环境中，按1:9的体积比，补加下列病毒维持液：RPMI-1640培养基 + 2%体积比(v/v）的小牛血清 + 2%体积比(v/v）的质量浓度为6.6%（w/v）的碳酸氢钠溶液，培养至第5天，于相同环境中，按2%的体积比补加质量浓度为6.6%(w/v)的碳酸氢钠溶液，培养至第8～9天，当白纹伊蚊细胞C6/36病变CPE达++++时,收集细胞液，于4℃，3500×g离心分离5min，收获上清，即得病毒液；如此连续传代培养三代以上，直至获得传代稳定的Ⅱ型登革病毒液；