[发明专利]Ⅱ型登革病毒KMB17细胞适应株及其制备方法

权利要求书

1.一种Ⅱ型登革病毒KMB17细胞适应株，其特征在于通过下列步骤获得：

1）、按1ml病毒液/瓶的量，将浓度为4.0MOI的Ⅱ型登革病毒液接种到生长致密，透明度好的白纹伊蚊细胞C6/36上，于温度为28+2℃、CO₂体积浓度为5%的环境中，恒温吸附1小时，于相同环境中，按1:9的体积比，补加下列病毒维持液：RPMI-1640培养基 + 2%体积比的小牛血清 + 2%体积比的质量浓度为6.6%的碳酸氢钠溶液，培养至第5天，于相同环境中，按2%的体积比补加质量浓度为6.6%的碳酸氢钠溶液，培养至第8～9天，当白纹伊蚊细胞C6/36病变CPE达++++时，收集细胞液，于4℃，3500×g离心分离5min，收获上清，即得病毒液；

2）、将步骤1所得病毒液，按1ml病毒液/瓶的量,接种到生长致密，透明度好的白纹伊蚊细胞C6/36上，于温度为28+2℃、CO₂体积浓度为5%的环境中，恒温吸附1小时，于相同环境中，按1:9的体积比，补加下列病毒维持液：RPMI-1640培养基 + 2%体积比的小牛血清 + 2%体积比的质量浓度为6.6%的碳酸氢钠溶液，培养至第5天，于相同环境中，按2%的体积比补加质量浓度为6.6%的碳酸氢钠溶液，培养至第8～9天，当白纹伊蚊细胞C6/36病变CPE达++++时,收集细胞液，于4℃，3500×g离心分离5min，收获上清，即得病毒液；如此连续传代培养三代以上，直至获得传代稳定的Ⅱ型登革病毒液；

3）、按1ml病毒液/瓶的量，将步骤2所得传代稳定的Ⅱ型登革病毒液，接种到铺满单层、生长状态良好且致密的人胚肺二倍体细胞KMB17上，同时按1:9的体积比，加入下列病毒维持液：MEM培养基 + 5%体积比的小牛血清 + 2%体积比的质量浓度为6.6%的碳酸氢钠，于温度为37+0.5℃、CO₂体积浓度为5%的环境中，恒温培养至第4天，于相同环境下，按2%的体积比补加质量浓度为6.6%的碳酸氢钠溶液，培养至第7天，当人胚肺二倍体细胞KMB17病变CPE达++++时，收获已出现细胞病变CPE的病毒液，并于-70℃下保存；

4）、将步骤3的病毒液反复冻融2次，于4℃，3500×g离心分离5min，收获上清，得病毒液，将该病毒液按1ml病毒液/瓶的量接种到铺满单层、生长状态良好且致密的人胚肺二倍体细胞KMB17上，同时按1:9的体积比，加入下列病毒维持液:MEM培养基 + 5%体积比的小牛血清 + 2%体积比的质量浓度为6.6%的碳酸氢钠；于温度为37+0.5℃、CO₂体积浓度为5%的环境中，恒温培养至第4天，于相同环境下，按2%的体积比补加质量浓度为6.6%的碳酸氢钠溶液，培养至人胚肺二倍体细胞KMB17病变CPE达++++时，获得能够在KMB17 细胞上增殖的登革病毒毒种，并于-70℃下保存；如此连续传代培养三代以上，直至获得传代稳定的Ⅱ型登革病毒液，即得到在人胚肺二倍体细胞KMB17上适应的Ⅱ型登革病毒适应株。

2.如权利要求1所述的Ⅱ型登革病毒KMB17细胞适应株，其特征在于所述每瓶的细胞数量为1～1.7×10⁶。

3.如权利要求1所述的Ⅱ型登革病毒KMB17细胞适应株，其特征在于所述步骤1）的白纹伊蚊细胞C6/36经过下列传代培养：按常规在细胞中加入下列细胞生长液：RPMI-1640培养基加10%体积比的小牛血清；放置于温度为28+2℃，CO₂体积浓度为5%的环境中，恒温培养，培养2-3天换液一次，培养4-5天细胞长成形态良好致密单层。

4.如权利要求1所述的Ⅱ型登革病毒KMB17细胞适应株，其特征在于所述步骤3）的人胚肺二倍体细胞KMB17经过下列培养：按常规细胞培养方法对KMB17细胞进行培养，所用细胞生长液为：MEM培养液加10%体积比的小牛血清，细胞传代培养2-3天，使细胞长成形态良好致密单层。