[发明专利]一种GBSS1比酶活测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种GBSS 1比酶活测定方法。

背景技术

水稻蜡质基因(Wx)编码的GBSS1(Granule-Bound Starch Synthase 1，2.4.1.242)负责水稻种子胚乳中直链淀粉的合成(Sano Y et al(1985).Gamma Field Symp,24:63-77；Shapter et al(2009).J.Cereal Sci,49:4-11)。水稻蜡质基因的表达量、GBSS1酶活的高低与胚乳中直链淀粉的含量呈显著正相关(Wang ZY et al(1995).The Plant Journal,7:613-622；Sano Y et al(2008).Theor Appl Genet,116:979-989)。近20多年来，水稻蜡质基因的表达与调控规律的研究及其在稻米品质改良上的应用研究取得了极大的进展。在上述研究过程中，GBSS1酶活的测定是经常用到的常规实验方法。

已有的GBSS1酶活的测定方法有两种，两种方法的原理都是根据GBSS1参与的酶促反应。第一种方法是用¹⁴C标记GBSS1酶促反应底物ADPG(腺苷二磷酸葡萄糖)中的葡萄糖加入反应体系，然后根据¹⁴C掺入反应产物中的量来定义其酶活水平(Singletary GW et al(1997).Plant Physiol,113:293-304)。第二种是间接测定的方法，它根据GBSS1参与的酶促反应中葡萄糖分子被转移入淀粉后，底物ADPG释放出ADP，再通过两步反应，最后检测NADPH的量来间接反映GBSS1的酶活。反应过程如下：

第一步反应是

第二步反应是

第三步反应是

上述两种方法能获得的都是样品中GBSS1酶活，但无法判断样品中酶活的不同是由于酶蛋白的量不同引起的还是比酶活的不同引起的。

因此，本领域有必要开发改进的GBSS1酶活测定方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种GBSS1比酶活测定方法。

在本发明的第一方面，提供一种测定作物种子中颗粒结合型淀粉合成酶(GBSS1酶)的比酶活的方法，所述方法包括：

(1)从作物种子中提取颗粒结合型淀粉合成酶，获得酶提取液，作为待测样品；采用酶联免疫吸附测定(ELISA)获得待测样品(GBSS1提取液)中颗粒结合型淀粉合成酶的蛋白量；

(2)将待测样品与支链淀粉、底物ADPG进行如(I)反应并记录颗粒结合型淀粉合成酶反应时间：

之后加入磷酸烯醇式丙酮酸(或其盐)、丙酮酸激酶，进行如(II)反应：

(3)测定反应(II)中生成的产物ATP的量，除以步骤(1)获得的颗粒结合型淀粉合成酶的蛋白量以及步骤(2)记录的颗粒结合型淀粉合成酶反应时间，获得颗粒结合型淀粉合成酶(GBSS1酶)的比酶活。

在另一优选例中，所述的作物种子为未成熟种子。

在另一优选例中，步骤(1)中，采用制作标准曲线的方法获得待测样品中颗粒结合型淀粉合成酶的蛋白量。

在另一优选例中，为了获得待测样品中颗粒结合型淀粉合成酶的蛋白量，标准曲线如下制作：将颗粒结合型淀粉合成酶标准品(较佳地，为原核表达纯化的，纯度>99%)进行梯度稀释，记录每一梯度酶浓度，蛋白变性后，应用酶颗粒结合型淀粉合成酶特异性抗体以及与酶颗粒结合型淀粉合成酶特异性抗体结合的带显色标记的二抗进行免疫反应，之后显色反应，测定光吸收值，将每一梯度酶浓度样品的光吸收值对酶浓度制成标准曲线。

在另一优选例中，获得待测样品中颗粒结合型淀粉合成酶的蛋白量包括：将待测样品进行蛋白变性，应用颗粒结合型淀粉合成酶特异性抗体以及与酶颗粒结合型淀粉合成酶特异性抗体结合的带显色标记的二抗进行免疫反应，之后进行显色反应，测定光吸收值；根据该获得的光吸收值，从标准曲线中获得相应的颗粒结合型淀粉合成酶的浓度；进而获得颗粒结合型淀粉合成酶的蛋白量。

在另一优选例中，采用制作标准曲线的方法测定产物ATP量。较佳地，将ATP标准品(较佳地，纯度>99%)进行梯度稀释，测定每一梯度浓度ATP的发光值，将获得的每一梯度浓度ATP的发光值对ATP浓度制成标准曲线。