[发明专利]一种GBSS1比酶活测定方法

权利要求书

1.一种测定作物种子中颗粒结合型淀粉合成酶的比酶活的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)从作物种子中提取颗粒结合型淀粉合成酶，获得酶提取液，作为待测样品；采用酶联免疫吸附测定获得待测样品中颗粒结合型淀粉合成酶的蛋白量；

(2)将待测样品与支链淀粉、底物ADPG进行如(I)反应并记录颗粒结合型淀粉合成酶反应时间：

之后加入磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸激酶，进行如(II)反应：

(3)测定反应(II)中生成的产物ATP的量，除以步骤(1)获得的颗粒结合型淀粉合成酶的蛋白量以及步骤(2)记录的颗粒结合型淀粉合成酶反应时间，获得颗粒结合型淀粉合成酶的比酶活。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，采用制作标准曲线的方法获得待测样品中颗粒结合型淀粉合成酶的蛋白量。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，标准曲线如下制作：将颗粒结合型淀粉合成酶标准品进行梯度稀释，记录每一梯度酶浓度，蛋白变性后，应用酶颗粒结合型淀粉合成酶特异性抗体以及与酶颗粒结合型淀粉合成酶特异性抗体结合的带显色标记的二抗进行免疫反应，之后显色反应，测定光吸收值，将每一梯度酶浓度样品的光吸收值对酶浓度制成标准曲线。

4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，获得待测样品中颗粒结合型淀粉合成酶的蛋白量包括：将待测样品进行蛋白变性，应用颗粒结合型淀粉合成酶特异性抗体以及与酶颗粒结合型淀粉合成酶特异性抗体结合的带显色标记的二抗进行免疫反应，之后进行显色反应，测定光吸收值；根据该获得的光吸收值，从标准曲线中获得相应的颗粒结合型淀粉合成酶的浓度；进而获得颗粒结合型淀粉合成酶的蛋白量。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，采用制作标准曲线的方法测定产物ATP量。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，将ATP标准品进行梯度稀释，测定每一梯度浓度ATP的发光值，将获得的每一梯度浓度ATP的发光值对ATP浓度制成标准曲线。

7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，测定产物ATP量的方法包括：

测定产物中ATP的发光值；根据该获得的光吸收值，从标准曲线中获得相应的ATP浓度；进而获得产物ATP量。

8.如权利要求2-7任一所述的方法，其特征在于，对所述的待测样品、产物进行倍数稀释。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(I)反应包括：将待测样品加入到反应液I中，待测样品与反应液I体积比为：1:(1.5-2.1)，反应10-30min，终止反应后冰浴；其中反应液I包括：50mmol/L HEPES-NaOH；1.6mmol/L ADPG；0.7mg/ml支链淀粉；15mmol/L DTT。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(II)反应包括：在(I)反应的产物中加入反应液II，30±2℃反应20±10min，终止反应；其中反应液II包括：50mmol/LHEPES-NaOH；4mmol/L PEP-K；200mmol/L KCl；10mmol/L MgCl₂；1.2单位丙酮酸激酶。