[发明专利]一种枯草芽孢杆菌及其在抗曲霉菌中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及微生物及微生物的检测及应用技术领域，特别涉及一种枯草芽孢杆菌及其在抗曲霉菌中的应用。 

背景技术

黄曲霉毒素作为一种天然毒素，在花生田间生长时就可产生。即便通过良好的管理规范也无法将黄曲霉毒素毒素从食物链中去除。生物控制法是刚刚新兴的一种方法，主要是利用微生物间的拮抗，寻找对黄曲霉有抑制作用的微生物；或者通过转基因技术对产毒黄曲霉进行基因修饰，使不产毒的黄曲霉成为可能污染食品的优势菌种，来达到对黄曲霉毒素的控制作用。它经济、有效、并且不会对环境造成二次污染，有望从源头对花生黄曲霉毒素污染加以控制。 

到目前为止，国内还没有开发出成型、经济的生物控制剂产品。生物控制剂作为黄曲霉毒素控制的一种很好的手段急需加以研究和开发。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，通过黄曲霉毒素平板筛选试验和产毒黄曲霉拮抗试验，从花生种植田间、储存仓库中筛选黄曲霉拮抗菌株。建立合理、有效的黄曲霉拮抗菌株的筛选方法，并对筛选出的拮抗菌的作用效果、安全性进行评估，得到适合需要的黄曲霉毒素抑制菌株。通过细菌分离，发酵培养；制备曲霉的培养及孢子悬液；筛选抗曲霉菌株；抗曲霉菌株的复筛等一系列工作，形成安全、有效、经济的黄曲霉毒素生物控制剂产品。将产品应用于农作物(花生等)收获前后以及储存期间等易被黄曲霉毒素污染的阶段，提高出口农作物(花生等)的黄曲霉毒素防控水平，降低出口风险，促进农作物(花生等)及其制品的出口贸易。 

为解决上述技术问题，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌对黄曲霉菌具有拮抗作用，其保藏编号为：CCTCC M 2012217。保藏日期为2012年6月8日。保藏于中国典型培养物保藏中心。保藏中心地址：中国.武汉.武汉大学。分类命名为：枯草芽孢杆菌21-1-2(Bacillus subtilis21-1-2)。为解决上述技术问题，本发明还提供了一种从土壤中筛选对黄曲霉菌具有拮抗作用的枯草芽孢杆菌的方法，包括以下步骤： 

a.细菌分离； 

b.曲霉的培养及孢子液的制备； 

c.抗曲霉菌株的筛选； 

d.抗曲霉菌株的复筛。 

所述步骤a可以进一步包括：称取土壤样品5～10g，加入50～100ml无菌生理盐水，涡旋混匀1～3min，制成体积比为1∶10的悬液，分别用微量移液器吸取100～200μl，涂布LB平板，37℃培养24～36h，挑取单菌落纯化。所述步骤b可以进一步包括：将产毒黄曲霉菌和无毒黄曲霉菌接种到PDA斜面，28℃培养6d，待孢子充分形成后，每个试管中加入4～8ml已灭菌的0.9％生理盐水，震荡后用血球计数板计数，并调至100～110/ml，4℃保存。 

所述步骤c可以进一步包括：移液枪取100μl步骤b制备好的孢子液于PDA平板上，涂布器将孢子液涂干；将步骤a分离纯化得到的菌株点种到平板上，每个菌株做两个平行样，28℃培养48h后观察试验菌株周围是否存在抑菌圈。 

所述步骤d可以进一步包括：用接种环取步骤c初筛过程中选出的有抑菌活性的菌株一环，接于LB液体培养基中37℃，190r/min发酵24～26h，8000r/min离心10～20min，用一次性滤器过滤滤除菌体；移液枪取100μl制备好的孢子液于PDA平板上，用涂布器将孢子液涂干，每个板上放置三个牛津杯，分别用移液枪加入100μl、200μl滤液，100μl生理盐水作为对照，置于28℃恒温培养箱中培养48h，观察试验菌株周围是否有抑菌圈并用十字测量法测定抑菌圈直径。 

为解决上述技术问题，本发明又提供了一种枯草芽孢杆菌，包含下述基因序列：