[发明专利]Y染色体微缺失检测的扩增组合物及检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术检测领域，特别是涉及Y染色体微缺失检测的扩增组合物、该检测方法以及检测用试剂盒。

背景技术

约15%育龄夫妇存在生育障碍，其中男性因素引起的生育障碍约占一半。在已知的导致男性不育的遗传学因素中，发病率最高的两种是Y染色体的微缺失和克氏综合症，在无精症或少精症患者中发病率在10-15%。

Y染色体具有大量重复序列和回文结构，这些结构在维持Y染色体进化稳定性的同时也使回文结构内部基因易于丢失，进而导致不育。缺失率最高的三个影响精子发生的区域被命名为AZFa，AZFb和AZFc，它们之中任何一个出现缺失都有可能导致不育症。除AZF各区的完全缺失外，还存在发生率很高的AZFb和/或AZFc区部分缺失或复制。近年研究工作表明，其中部分类型的缺失或复制与男性不育相关，如g1/g3（b2/b3）缺失或gr/gr复制与汉人种不育相关。

Y染色体微缺失检测已成为男性不育患者的常规检查项目。随着辅助生殖技术的进展，卵细胞胞浆内精子注射（ICSI）技术和其他人工辅助生殖治疗时也要求对Y染色体微缺失进行检测，以避免将缺陷遗传给下一代及避免无谓的治疗。

目前检测Y微缺失的方法有多种，包括核型分析、FISH、芯片、多重PCR等方法，其中使用最为广泛的是多重PCR联合琼脂糖电泳检测的方法。该方法是在PCR反应体系中同时加入3-5对引物，在同一反应体系中一次实验扩增多个区域片段DNA的基因扩增，通过琼脂糖电泳检测有无目的产物以判断是否存在微缺失。

国内外众多产品或专利都是基于此方法开发出来的（200410043918，Y染色体细微缺失诊断试剂和对其进行PCR扩增的方法；200910094618.8，一种Y染色体微缺失的基因检测方法）。

目前采用的方法的主要缺点在于：

①，检测一个样品需要多个PCR扩增反应，检测成本高、操作强度大。

由于采用琼脂糖电泳检测，方法分辨率和灵敏度限制，每一个扩增反应中难以同时进行更大量位点扩增，目前市场上产品和相关专利中每个扩增反应只扩增4-5个位点。所以，即使只检测EAA/EMQN标准的位点也需要2个扩增反应，而且随着检测位点的增加会需要更多的扩增反应（如亚能试剂盒需要4个反应，Promega试剂盒检测一个样本需要5个扩增反应和5个检测），这就大大增加了操作强度和检测成本，对于大规模样本筛查来说，工作量非常庞大。

②，扩增产物通过琼脂糖电泳检测，检测效率低、灵敏度低、错误率高。

琼脂糖电泳需要大量人工操作，从制胶到点样、电泳和读取信号需要1-2小时，不便于大量样本检测；而且琼脂糖电泳检测灵敏度低，产物量较少的时候条带不容易判别，难以区分弱阳性与阴性，容易造成假阳性或假阴性；如果电泳条件不稳定或操作不当容易造成样本混淆，得出错误判断。

③，不能检测部分缺失和复制。

区分Y染色体AZF区域的部分缺失和复制是有重大应用意义的。一方面，部分缺失或复制在人群中发生比例很高。据文献和我们的数据，几种常见部分缺失或复制的在无精症少精症患者中的比例超过10%，而能被多重定性PCR技术有效检测的AZF各区完全缺失，公认的比例也只有10%左右。另一方面，近年研究工作表明一些常见部分缺失或复制和育性及染色体遗传稳定性直接相关，如g1/g3（b2/b4）缺失或gr/gr复制与汉人种不育相关。

但是，由于部分缺失和复制高发的AZFb/c区序列由高度一致的回文结构组成，难以选择单拷贝的特异位点进行检测；同时，由于多重定性PCR技术只能检测扩增产物的有或者无，无法通过定量检测区分染色体上重复DNA片段部分缺失和复制。因此多重定性PCR技术难以检测部分缺失和复制，会将部分缺失和复制误判为正常，影响后续诊疗或相关处理。

发明内容

本发明的目的是提供Y染色体微缺失检测的扩增组合物，在高度复合的扩增体系中可以扩增多至30个与Y染色体微缺失检测相关的位点，且通过重定量荧光PCR（QF-PCR）技术扩增Y染色体微缺失检测相关的位点，并根据有无扩增产物及扩增产物剂量确定是否存在Y染色体微缺失异常。

本发明的另一个目的在于提供一种Y染色体微缺失检测试剂盒。该试剂盒利用多重荧光PCR扩增体系，通过该试剂盒可实现仅以一个扩增检测反应完成对样品Y染色体微缺失进行简便、稳定、准确、精细、高效地检测。

Y染色体微缺失检测的扩增组合物，其特征在于：所述扩增组合物中包括8对引物，可同时扩增8个与Y染色体微缺失检测相关的位点：