[发明专利]检测残留齐帕特罗的酶联免疫试剂盒及其使用方法

说明书

技术领域

本发明公开了一种检测动物组织及其代谢物中齐帕特罗的酶联免疫试剂盒及其检测方法，属于酶联免疫吸附分析方法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA )技术领域。本发明涉及用于检测动物源食品、血液及尿液中残留的齐帕特罗的含量的酶联免疫试剂盒及使用该试剂盒的检测方法。 

背景技术

 β₂-肾上腺素受体激动剂能增加肌肉/脂肪比，此类物质被用于动物养殖中时，可明显提高饲养动物瘦肉率。但大量使用或长期超量使用，且不遵守安全停药期，则会在饲养动物组织中蓄积，人食用了这种动物组织后会引起中毒甚至死亡，因此很多国家和国际组织已经禁止这类化合物用于食品动物饲养。齐帕特罗(Zilpaterol)是一种新型β₂ -肾上腺素能激动剂，其化学结构 (见式 1)与常见的苯胺类-肾上腺素类激动剂(克仑特罗和沙丁胺醇)和苯酚类β -肾上腺素类激动剂 (莱克多巴胺)是完全不同的，它的作用效果相当于克仑特罗的十分之一，但比莱克多巴胺更有效。在墨西哥和南非齐帕特罗被允许作为宰杀期牛的饲料添加剂使用，但是在欧盟被明令禁止使用。 

式 1 齐帕特罗的化学结构 

目前，欧盟国家对齐帕特罗使用和动物组织中残留方面的研究较多实验方法涉及气相色谱-质谱联用法、高效液相色谱-串联质谱法等。气质联用法均需要对样品进行衍生， 操作步骤多，实验时间长，而高效液相色谱-串连质谱法对仪器设备要求高，通常需要利用氘代内标物质，实验步骤较复杂。因此，建立一种简单、快速、准确、可靠的检测方法，对齐帕特罗的使用进行监控是非常必要的。本发明的目的是研制一种更适合企业进行现场检测且快捷简便、成本低廉的定性检测方法。

现有技术对于齐帕特罗的检测主要是高效液相色谱-串联质谱法、高效液相色谱法等检测方法，但这些方法的检测过程繁琐、检测时间长，需要的设备昂贵，操作复杂，难于推广。根据我国目前已经形成的一套兽药残留监控检测技术，ELISA作为一种准确、灵敏性、高性价比的检测方法，是食品安全监测、兽药残留监测领域进行筛选的理想方法。本发明通过特有的免疫动物制备具有高亲和力、高特异性的齐帕特罗抗体，建立一种可以检测齐帕特罗的间接竞争ELISA检测方法。本方法具有操作简便、快捷，灵敏度高、特异性好等特点。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题：提供一种能够快速且准确的检测出残留齐帕特罗的酶联免疫试剂盒。本发明所要解决的另一个技术问题是提供以一种操作简单、耗时短、检测灵敏度高且适用于大批量样品检测的检测残留齐帕特罗的方法。 

为解决所述技术问题，经过大量实验研究分析，本发明提供了以下技术方案来解决所述技术问题： 

一种检测残留齐帕特罗的酶联免疫试剂盒，包括酶标板96孔、齐帕特罗标准品工作液各1 mL、齐帕特罗抗体工作液7 mL、齐帕特罗酶标二抗工作液12 mL、底物液12 mL、终止液7 mL、浓缩洗涤液40 mL和浓缩样品稀释液40 mL；

其中，所述酶标板是包被齐帕特罗抗原的酶标板，齐帕特罗抗原是用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸盐包被缓冲液(CBS)稀释成1:8000比例，100 μL/孔，37℃，2h，取出4℃放置过夜；取出酶标板甩掉板内液体，用稀释后的浓缩洗涤液300 μL/孔，洗板3次，1min/次；然后加入0.5% BSA封闭，150 μL/孔，37℃放置2 h；取出酶标板甩掉板内液体，用洁净的毛巾包裹后拍干板内残留液体；将拍干后的酶标板整齐地摆放置GMP车间恒温（25℃）晾干；抽检要求板内孔与孔之间，板间的OD值变异系数均小于10%；检验合格后将酶标板密封后置4℃下保存；

其中，所述齐帕特罗标准品的浓度分别为0 ng/mL、0.1 ng/mL、0.3 ng/mL、0.9 ng/mL、2.7 ng/mL、8.1 ng/mL；

其中，所述齐帕特罗抗体工作液是用抗体稀释液稀释成1:10000比例；

所述齐帕特罗酶标二抗工作液是用酶标二抗稀释液稀释成1:2000比例；

所述底物液包含0.05 mol/L的NaHPO₄·12H₂O、0.025 mol/L的一水柠檬酸(C₆H₈O₇·H₂O)、0.2 mmol/L的3，3，5，5-四甲基联苯胺(TMB）、0.5 mmol/L的过氧化氢脲和5%的N，N-二甲基甲酰胺；