[发明专利]β-1,3-葡聚糖识别蛋白及其制备方法和应用

说明书

技术领域：

本发明涉及生物医药技术领域，涉及β-1，3-葡聚糖识别蛋白的结构及其获得方法与应用，具体地说，本发明涉及β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其衍生物、类似物、活性片段的结构及其制备生产方法，以及其在微生物及其相关分子模式检测、诱导昆虫产生抗菌肽、制备β-1，3-葡聚糖识别蛋白及其衍生物、类似物、活性片段抗体等方面的应用。

背景技术：

先天性免疫是一种古老的宿主防御机制，对“非己”的识别策略不在于它们能识别每一个可能的抗原，而是能够识别在微生物(病原体)中普遍存在的高度保守的共有结构。这种不同于获得性免疫系统的识别方式被称为模式识别作用(Pattern recognition)。模式识别作用中包含两种不可或缺的成分，即微生物中普遍存在的高度保守的共有结构—病原体相关的分子模式和宿主体内的先天性免疫识别分子-模式识别受体。

微生物中普遍存在的高度保守的共有结构被称为病原体相关的分子模式，(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)。已报道的PAMPs包括细菌脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)、肽聚糖(Peptidoglycan，PGN)、脂磷壁酸(Lipoteichoic acids，LTA)；分枝杆菌的脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)、甘露聚糖(Mannan)；细菌DNA中未甲基化的CpG模体；RNA病毒中的双链RNA；真菌的葡聚糖(Glucan)；以及许多细菌、病毒、真菌及寄生虫表面的以甘露糖(Man)、乙酰氨基甘露糖(ManNAc)、乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)等为末端糖基的糖结构，等等。尽管这些PAMPs的化学结构极为不同，但它们具有共同的特征：PAMPs由微生物(病原体)产生；PAMPs代表的是对微生物的生存所必需的保守的分子模式；PAMPs为一大组微生物所共有。

先天性免疫系统中能够识别PAMPs的受体称为模式识别受体(Pattern recognition receptors，PRRs)，也称模式识别蛋白(识别蛋白)。这些受体通过与特异性PAMPs的结合激活存在于该生物体内的特定蛋白酶类和利用免疫反应组织的细胞内信号转导途径而引起该生物体免疫反应。除此之外，PRRs还可以作为促进吞噬的调理素，或是凝集、黑化及其他蛋白质修饰级联反应等免疫过程的起始因子。

其中，能与β-1，3-葡聚糖发生特异性结合的蛋白被称为β-1，3-葡聚糖识别蛋白，也称β-1，3-葡聚糖模式识别受体(βGRP)。目前在果蝇体内没有发现仅与β-1，3-葡聚糖结合的蛋白质，但在家蚕、烟草天蛾、黄粉虫等许多昆虫体内则发现β-1，3-葡聚糖识别蛋白，并且在与β-1，3-葡聚糖结合后可诱导自身酚氧化酶的活性以及进一步激活Toll信号传递途径。1988年Masaaki Ashida等人从家蚕中发现了第一个能够与β-1，3-葡聚糖发生特异性结合的蛋白质，该蛋白的分子量为63k Da，等电点为4.3，并能激活家蚕体内的酚氧化酶原级联放大反应，从而进一步激活Toll信号传递途径。随后，在烟草天蛾、按蚊、黄粉虫中发现的βGRPs在序列特点、组织分布、分子量等方面与家蚕中的βGRP具有相似之处。纯化后的βGRPs可不同程度的与β-1，3-葡聚糖发生特异性的结合而不与肽聚糖结合，其中烟草天蛾βGRP还可以一定程度的与磷壁酸特异性结合。实验证明，这些βGRPs均参与受真菌感染后的酚氧化酶原级联放大反应以及Toll信号传递途径的激活。

在浅水螯虾中发现了一种βGRP，其特殊之处在于该蛋白与脂多糖、β-1，3-葡聚糖具有相似的结合特异性而与肽聚糖不发生结合。分子量为40kDa。其结构与革兰阴性菌结合蛋白及葡聚糖酶的同源性较高，无葡聚糖酶催化能力。其多克隆抗体可以抑制由β-1，3-葡聚糖所介导的酚氧化酶的激活。

另外，鲎体内凝固因子G是目前发现的唯一一个既可以特异性结合β-1，3-葡聚糖，又具有丝氨酸蛋白酶活性的蛋白质。该蛋白质是由两种不同类型的亚基组成的异源二聚体，参与由β-1，3-葡聚糖引起的鲎血液凝集作用。对两个亚基分别进行研究后发现，β亚基是一个丝氨酸蛋白酶原而α亚基具有与β-1，3-葡聚糖特异性结合的能力。当α亚基与β-1，3-葡聚糖结合后，可引起β亚基的自动激活。