[发明专利]循环酶法乙醇浓度检测试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及一种循环酶法检测唾液中乙醇含量的试剂盒及其制备方法。

背景技术

近年来，酒后引起的刑事案件和交通事故案不断上升，2011年5月1日《中华人民共和国刑法修正案(八)》正式实施，醉酒驾驶作为危险驾驶罪被追究驾驶人刑事责任，有关酒驾的话题再次成为人们关注的焦点。

目前，许多国家都制定了血液中乙醇浓度与交通事故责任认定的关系，建立了多种能够检测血液中乙醇含量的方法，如GM/MS法等，虽然这些方法可以准确定量，但是存在着购买仪器价格昂贵，检测成本高，需专门培训，无法在案发现场快速检测等缺点。相比之下，唾液比血液容易获取，并且不存在交叉感染，因此基本不存在卫生安全隐患，同时唾液采集便捷，可避免采血导致的疼痛，属于无创诊断技术，因而人们更青睐于唾液乙醇检测。大量研究表明，人体在摄入乙醇后唾液和血液中的乙醇含量几乎相等，唾液/血液中乙醇的比值大约是1.07，因此检测唾液中的乙醇含量可以反映血液中的乙醇浓度。

目前市场上有很多便于携带的乙醇检测试剂条，但皆存在如下缺陷：(1)试剂反应后颜色会很快消褪；(2)反应灵敏度较低，且生成的产物堆积对反应起抑制作用，影响检测的准确度。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种乙醇浓度检测试剂盒，用该试剂盒进行乙醇浓度检测时简便卫生、速度快、灵敏度高、稳定性高，且该试剂盒易携带、尤其适合现场检测。

一种乙醇浓度检测试剂盒，由试剂条和标准比对卡组成，其中试剂条为宽0.5-1cm的滤纸条，滤纸条上含有固相化的乙醇氧化酶、乙醇脱氢酶、辣根过氧化物酶、还原型辅酶I、4-乙酰氧基氮杂环丁酮(4-AAP)、苯胺类似物和呈色稳定剂，标准比对卡包括不同乙醇浓度的显色比对区。

根据唾液和血液中乙醇含量一致性的实验基础，该乙醇浓度检测试剂盒的反应原理为采用循环酶法进行乙醇浓度测定，具体为：在氧气的存在下，乙醇在乙醇氧化酶的作用下生成乙醛及过氧化氢，反应生成的乙醛在乙醇脱氢酶的作用下又能生成乙醇，形成循环反应，这个循环反应可以使检测信号明显放大，循环累计生成的过氧化氢在辣根过氧化物酶，4-AAP，苯胺类似物和呈色稳定剂的存在下显色，具体的反应原理如下：

H₂O₂+4-AAP+苯胺类似物→显色

在以上反应中，颜色深浅和唾液中乙醇的浓度成线性关系。将试剂条直接放入嘴中，或蘸取少量刚吐入器皿的唾液，等待1分钟后取出，挥干5分钟后，与标准比对卡进行比对，半定量测定唾液中的乙醇浓度。而根据人体唾液和血液中乙醇浓度一致性的实验基础，人体唾液中乙醇浓度即能代表人体血液中乙醇浓度。

本发明中所述呈色稳定剂为吐温20、吐温80、布里杰-35(Brij-35)、曲拉通100(曲拉通X-100)等非离子表面活性剂中的一种。

本发明中所述的苯胺类似物为N-乙基-N-(2-羟基-3-丙磺基)间甲苯胺，N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐，N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺钠盐(二水合物)，N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺钠盐，N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺钠盐，N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺钠盐，N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺钠盐，N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺钠盐，N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺钠盐中的一种。

作为优选，所述标准比对卡包括乙醇浓度分别为0mg/ml、0.2mg/ml、0.8mg/ml、1.5mg/ml、3.0mg/ml的五个显色比对区。

本发明的突出实质性特点及显著进步主要表现在：

1)采用循环酶法，反应速度快、灵敏度高，且成本较低，并通过循环方式，消除了产物堆积对反应的抑制作用。

2)将酶和底物固定在试纸条上，使得质量更加稳定。

3)通过加入稳定剂，使反应后的色泽在避光封闭条件下稳定。

4)该试剂盒为试剂条，一人一条，非常卫生。由试剂条和标准比对卡组成的试剂盒携带方便，适合现场检测。

本发明还提供该乙醇浓度检测试剂盒的制备方法，用该制备方法制得的试剂盒在保证检测精确和准确性的同时，成本低廉。

该乙醇浓度检测试剂盒的制备方法包括试剂条的制备和标准比对卡的制备，其中：

试剂条的制备包括以下步骤：

(1)配制乙醇氧化酶、辣根过氧化物酶和乙醇脱氢酶液