[发明专利]循环酶法乙醇浓度检测试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种乙醇浓度检测试剂盒，其特征在于：由试剂条和标准比对卡组成，其中试剂条为宽0.5-1cm的滤纸条，滤纸条上含有固相化的乙醇氧化酶、乙醇脱氢酶、辣根过氧化物酶、还原型辅酶I、4-乙酰氧基氮杂环丁酮、苯胺类似物和呈色稳定剂，标准比对卡包括不同乙醇浓度的显色比对区。

2.根据权利要求1所述的乙醇浓度检测试剂盒，其特征在于：所述苯胺类似物为N-乙基-N-(2-羟基-3-丙磺基)间甲苯胺，N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐，N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺钠盐(二水合物)，N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺钠盐，N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺钠盐，N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺钠盐，N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺钠盐，N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺钠盐，N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺钠盐中的一种。

3.根据权利要求1所述的乙醇浓度检测试剂盒，其特征在于：所述呈色稳定剂为吐温20、吐温80、布里杰-35(Brij-35)、曲拉通100(曲拉通X-100)等非离子表面活性剂中的一种。

4.根据权利要求1所述的乙醇浓度检测试剂盒，其特征在于：所述标准比对卡包括乙醇浓度分别为0mg/ml、0.2mg/ml、0.8mg/ml、1.5mg/ml、3.0mg/ml的五个显色比对区。

5.权利要求1所述的乙醇浓度检测试剂盒的制备方法，其特征在于：包括试剂条的制备和标准比对卡的制备，其中：

试剂条的制备包括以下步骤：

(1)配制乙醇氧化酶、辣根过氧化物酶和乙醇脱氢酶液：将乙醇氧化酶溶于pH7.0-9.0的0.1-1M三羟甲基氨基缓冲液中，使每毫升的缓冲液中酶的总活性为100-200U，再加入100-200U/ml的辣根过氧化物酶，搅拌均匀，充分溶解后，再加入乙醇脱氢酶100-500U/ml。

(2)配制4-AAP和苯胺类似物溶液：将10-500mg4-AAP溶于50-500ml水中，再加入50-1000mg苯胺类似物，搅拌均匀，充分溶解后，再加入呈色稳定剂5-15g。

(3)配制还原型辅酶I溶液：将1-10g还原型辅酶I溶于50-500ml水中。

(4)酶和底物的固相化：将滤纸浸入(1)酶混合液中取出滤纸干燥；将(2)溶液滴在已干燥的滤纸上，干燥；将(3)溶液滴在已干燥的滤纸上，干燥。

(5)制备试剂条：将步骤(4)中干燥后的滤纸贴在单面含胶的白色聚酯板的前端，用切纸机切成宽0.5-1cm的长条，即成检测试剂条；

标准比对卡的制备步骤为：

将浓度为0mg/ml、0.2mg/ml、0.8mg/ml、1.5mg/ml、3.0mg/ml的乙醇分别滴加到制备成的试纸条上，30℃热风、避光下干燥10min，用扫描仪输入电脑中，用photoshop软件吸管测量颜色信息，根据每个浓度梯度颜色值用Photoshop6.0软件制成5个梯度的标准比色卡，即成标准比对卡。