[发明专利]一种快捷有效的窖泥古菌群落分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种窖泥微生物群落的分析方法，尤其是浓香型白酒窖泥古菌群落及多样性特征的分析方法。

背景技术

随着分子生物学技术的快速发展，以PCR技术为核心的现代分子生物学免培法被广泛应用于环境微生物群落及多样性特征的评价。高质量、高纯度基因组DNA的提取是成功进行PCR扩增及环境微生物群落特征解析的首要前提。然而，由于微生物细胞结构的复杂性及采样环境的特殊性，提取的粗DNA往往含量低、纯度低。研究表明，腐殖质及其类似物对环境基因组DNA的污染及提取过程微生物细胞破壁是否充分均是影响DNA质量的关键因素。目前已有诸多关于底泥、土壤、沉积物、活性污泥等基因组DNA提取过程去除腐殖质及细胞破壁处理的相关报道。有如专利申请号为201010183580.4记载了一种池塘底泥样品高纯度总DNA的提取方法，具体涉及样品总DNA提取前采用EDTA及PBS缓冲液对池塘底泥进行预处理，并将提取的粗DNA过柱纯化。有如专利申请号为201110089153.4公布了一种厌氧反应器中活性污泥DNA的提取方法，其特征在于结合了TENP、PBS缓冲液进行预处理及细胞破壁过程的反复冻融，以提高DNA的含量及纯度。有如专利申请号为201210107413.0报道了一种大曲酒窖泥微生物总DNA提取的前处理方法，通过含吐温-80的灭菌生理盐水、无水乙醇及无菌水进行反复洗涤以去除窖泥中的酸、醇及酯类组分。然而，柱纯化必然会导致基因组DNA的大量损失，反复冻融过程未必能将古菌细胞壁有效裂解，对DNA的释放有一定局限性。同时，由于酿酒窖池窖泥处于高酸、高醇的特殊微环境及古菌的复杂细胞结构，如窖泥特征性古菌产甲烷菌的细胞壁含假肽聚糖，甲烷八叠球菌不含假肽聚糖而含复杂聚多糖，不受溶菌酶和内酰胺抗生素的作用。前述方法应用于研究窖泥古菌群落结构均存在一定局限性。因此，一种针对腐殖质污染及古菌特殊细胞结构的DNA提取、扩增的方法显得十分必要。

发明内容

针对现有窖池窖泥微生物群落多样性分析技术手段的局限性，本发明的目的在于提供一种针对腐殖质污染及古菌特殊细胞结构的DNA提取、扩增方法。

本发明采用了以下技术方案：

1）样品预处理：

称取5g样品，加入20mL无菌PBS，充分混匀，加入5mL 0.1mol/L硫酸铝溶液，轻摇混匀后800r/min离心，收集上清液；重复洗涤沉淀并合并上清液，该过程可视上清液浑浊程度添加适量0.1mol/L硫酸铝溶液，10000r/min离心10min，弃上清液。

2）基因组DNA提取：

①将1）所得沉淀溶解于500μLDNA提取缓冲液（0.1M Tris-HCl，0.1M EDTA，1.5M NaCl，1%CTAB，pH8.0），加入溶菌酶（100mg/mL）、纤维素酶（200mg/mL）、蜗牛酶（100mg/mL）及消化肽酶（250U/mL） 各20μL，37℃水浴2h；

②向上述样品中加入20% SDS 25μL，65℃保温1.5h；

③向上述样品中加入10μL蛋白酶K（250mg/mL），55℃水浴摇床1h， 5000r/min离心4min，转移上清液；

④向上述上清液中加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），摇匀，10000r/min离心10min，收集上清液；

⑤向上述上清液中加入等体积氯仿：异戊醇（24:1），摇匀，10000r/min离心10min，收集上清液；

⑥向上述上清液中加入0.6倍体积预冷的异丙醇，-20℃下放置2h以上，10000r/min离心20min，去上清液，沉淀用预冷的70%乙醇洗涤1~2次后吹干；

⑦将DNA溶解于50~100μL TE中，-20℃保存。

3）PCR扩增

PCR扩增采用巢式PCR方式进行，第一轮扩增体系为50 uL：25uL 2×Taq Master Mix，引物PRA46f/PREA1100r （10umol/L）各2uL，模板2uL，ddH₂O补足50uL；第二轮扩增体系为50uL：25uL 2×Taq Master Mix，引物PARCH340f-GC/PARCH519r（10umol/L）各2uL，第一轮扩增产物2uL，ddH₂O补足50uL。