[发明专利]一种快捷有效的窖泥古菌群落分析方法

权利要求书

1.一种快捷有效的窖泥古菌群落分析方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

1）样品预处理：

①称取5g样品，加入20mL无菌PBS，充分混匀，加入5mL 0.1mol/L硫酸铝溶液，轻摇混匀后800r/min离心，收集上清液；

②重复洗涤沉淀并合并上清液，该过程可视上清液浑浊程度添加适量0.1mol/L硫酸铝溶液，10000r/min离心10min，弃上清液。

2）基因组DNA提取：

①将1）所得沉淀溶解于500μLDNA提取缓冲液（0.1M Tris-HCl，0.1M EDTA，1.5M NaCl，1%CTAB，pH8.0），加入溶菌酶（100mg/mL）、纤维素酶（200mg/mL）、蜗牛酶（100mg/mL）及消化肽酶（250U/mL） 各20μL，37℃水浴2h；

②向上述样品中加入20% SDS 25μL，65℃保温1.5h；

③向上述样品中加入10μL蛋白酶K（250mg/mL），55℃水浴1h， 5000r/min离心4min，转移上清液；

④向上述上清液中加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），摇匀，10000r/min离心10min，收集上清液；

⑤向上述上清液中加入等体积氯仿：异戊醇（24:1），摇匀，10000r/min离心10min，收集上清液；

⑥向上述上清液中加入0.6倍体积预冷的异丙醇，-20℃下放置2h以上，10000r/min离心20min，去上清液，沉淀用预冷的70%乙醇洗涤1~2次后吹干；

⑦将DNA溶解于50~100μL TE中，-20℃保存。

3）PCR扩增                  

PCR扩增采用巢式PCR方式进行，第一轮扩增体系为50uL：25uL Taq酶反应体系混合液，引物PRA46f/PREA1100r （10umol/L）各2uL，模板2uL，ddH₂O补足50uL；第二轮扩增体系为50uL：25uL Taq酶反应体系混合液，引物PARCH340f-GC/PARCH519r（10umol/L）各2uL，第一轮扩增产物2uL，ddH₂O补足50uL。

扩增条件为92℃预变性2min，92℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸6min，产物用1%琼脂糖凝胶电泳检验。DGGE变性剂浓度梯度为35%~65%，1×TAE电泳缓冲液，60℃，130V，电泳5h后SYBR Green I立即染色。

2.根据权利要求1所述一种有效的窖泥古菌群落分析方法，其特征在于所述步骤3）中Taq酶反应体系混合液为2×Taq Master Mix。