[发明专利]重组人长效白介素1受体拮抗剂融合蛋白的纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质纯化领域，更具体地，本发明提供了一种重组人长效白介素1受体拮抗剂融合蛋白的纯化方法。

背景技术

作为一个主要的免疫调节因子，白介素-1(Interleukin-1，IL-1)在机体的免疫及能量代谢调节中起到重要的作用。研究发现，IL-1在自身免疫性疾病如类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)、多发性硬皮病(Systemic sclerosis)、II型糖尿病(Type2 diabetes)、肥胖症(Obesity)的发病过程中起到非常重要的作用，最近的研究表明，IL-1还与某些种类的心血管疾病的发生相关。

白介素1受体拮抗剂(Interleukin-1 receptor antagonist，IL-1Ra)是人体内天然存在的一种蛋白质分子，其在体内可以与IL-1的受体特异性地结合，灭活相应的信号传导途径，从而对IL-1引起的机体损伤有保护作用。通过GenBank查询可以得到人白介素1受体拮抗剂的全基因序列，本专利中IL-1Ra的基因序列对应GenBank号为M63099.1。美国食品和药品管理局（FDA）在2001年11月批准Amgen（安进）公司的重组人IL-1Ra(Kineret?，Anakinra)上市，主要用于对常规药物无效的顽固性类风湿关节炎患者，目前该药也用于II型糖尿病的治疗，并取得了良好的效果。Anakinra为大肠杆菌表达的重组IL-1Ra蛋白质，治疗期间需每天注射给药，频繁的用药加重了病人的身体、心理和经济负担，因此长效的IL-1Ra的研究开发具有重要意义。

将目的蛋白质与生物体内天然存在的蛋白质进行融合表达，是一种延长药物生物学半寿期的主要方式之一。目前常用的载体蛋白质有两种：人血清白蛋白（Human serum albumin，HSA），通过GenBank查询可以得到人血清白蛋白的全基因序列，本专利中HSA基因序列对应GenBank号为NM_000477。通过酵母细胞分泌表达获得融合蛋白，如美国HGS公司研制的长效HSA-干扰素融合蛋白，目前已经进入临床使用。其在体内的平均半衰期为157个小时，只需每二周注射一次即可获得比较满意的临床治疗效果；另一种载体为免疫球蛋白的Fc片段，通常选择CHO细胞作为宿主细胞进行表达，如上海中信国健药业有限公司生产的益赛普注射液为人II型肿瘤坏死因子受体-抗体的融合蛋白，临床上用于中度及重度活动性类风湿性关节炎患者的治疗。

目前，陈枢青等已经构建了四种由HSA与IL1-Ra通过不同方式融合的重组人长效白介素1受体拮抗剂融合蛋白的表达载体，分别为pPIC9-HSA-IL1-Ra质粒、pPIC9-HSA-(G)_n-IL1-Ra质粒、pPIC9-IL1-Ra-HSA质粒和pPIC9-IL1-Ra-(G)_n-HSA质粒（专利号：ZL 200810060568.7），本发明将该专利全文引用，这四种表达载体通过电击转化插入到毕赤酵母菌株GS115或SMD1168中，表达出的四种融合蛋白分别为：HSA-IL-1Ra（无连接肽，本文简称HI融合蛋白）、HSA-(G)_n -IL-1Ra（本文简称H(G)nI融合蛋白）、IL-1Ra-HSA（无连接肽，本文简称IH融合蛋白）、IL-1-(G)_n -HSA（本文简称I(G)nH融合蛋白）；所述(G)_n的序列为[GlyGlyGlyGlySer]n，n为1-4 的整数。沈其等对HSA-G-IL-1Ra的摇瓶发酵液上清在实验室规模进行纯化，先经亲和层析，最后用Q Sepharose XL层析得到纯化产物（沈其，陈枢青.HSA／IL1ra融合蛋白的纯化及生物学活性研究.浙江大学学报,2009, Vol 38,No 3:260-264）。