[发明专利]重组人长效白介素1受体拮抗剂融合蛋白的纯化方法

权利要求书

1.一种重组人长效白介素1受体拮抗剂融合蛋白的纯化方法，该方法包括：

（1）将能够表达重组人长效白介素1受体拮抗剂融合蛋白的基因工程菌株进行发酵表达，获得含有目的蛋白的发酵液，经预处理制得含目的蛋白的浓缩液，所述目的蛋白为HSA-IL-1Ra、HSA-（G）_n-IL-1Ra、IL-1Ra-HSA或IL-1Ra-（G）_n-HSA，其中（G）_n为肽接头，G的序列为GlyGlyGlyGlySer，n为1-4的整数； 

（2）将上步所得的浓缩液进行强阴离子交换层析，获得含目的蛋白的洗脱液，所用层析介质含有季铵基或季铵乙基配基且所用介质的基质为琼脂糖或葡聚糖；

（3）将上步所得洗脱液进行蓝胶亲和层析，获得含目的蛋白的洗脱液，所用层析介质含有Cibacron Blue配基；

（4）将上步所得洗脱液进行弱阴离子交换层析，获得含目的蛋白的洗脱液，其中弱阴离子交换层析所用介质含有二乙基氨基乙基配基，所述介质的基质为琼脂糖、葡聚糖或聚甲基丙烯酸甲酯；所用洗脱目的蛋白的缓冲液含有10~50mM NaH₂PO₄和20~35mM NaCl，pH为5.5~6.5。

2.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述重组人长效白介素1受体拮抗剂融合蛋白为IL-1Ra-G-HSA融合蛋白，G的序列为GlyGlyGlyGlySer。

3.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤1发酵中，目的蛋白的表达形式为分泌表达，所用表达载体为pPICZαA、pPICZαB、pPICZαC、pPIC9或pPIC9K：当载体为pPICZαA、pPICZαB或pPICZαC时，所用宿主细胞为巴斯德毕赤酵母X33；当载体为pPIC9或pPIC9K时，所用宿主细胞为巴斯德毕赤酵母GS115或巴斯德毕赤酵母SMD1168。

4.如权利要求1-3任一项所述的纯化方法，其特征在于，步骤4所用的弱阴离子交换层析介质选自DEAE Sepharose CL-6B、DEAE Sepharose F.F.、DEAE Sephadex A-50、DEAE-650M、DEAE-650C和Macro-Prep DEAE，优选DEAE Sepharose CL-6B。

5.如权利要求4所述的纯化方法，其特征在于，步骤4中：层析前预先将柱平衡，所用平衡缓冲液含有10~50mM NaH₂PO₄和20mM NaCl，pH为5.5~6.5，优选平衡缓冲液含有20mM NaH₂PO₄和20mM NaCl，pH为5.5或6.5；所用洗脱目的蛋白的缓冲液为含有20mM NaH₂PO₄和35mM NaCl、pH为5.5的缓冲液，或为含有20mM NaH₂PO₄和20mM NaCl、pH 6.5的缓冲液。

6.如权利要求1-3任一项所述的纯化方法，其特征在于，步骤2所述的强阴离子交换层析介质为Q Sepharose Fast Flow、QAE Sephadex A-50或QAE-550C，优选Q Sepharose Fast Flow。

7.如权利要求6所述的纯化方法，其特征在于，步骤2中：层析前预先将柱平衡，所用平衡缓冲液A₁含有10~50mM Tris和10~50mM NaCl，pH为6.5~7.5，优选平衡缓冲液A₁含有20mM Tris和20mM NaCl，pH为7.0；所用洗脱缓冲液B₁含有10~50mM Tris和100~200mM NaCl，pH为6.5~7.5，优选洗脱缓冲液B₁含有20mM Tris和160mM NaCl，pH为7.0。

8.如权利要求1-3任一项所述的纯化方法，其特征在于，步骤3所述的亲和层析介质选自AF-Blue HC-650M、Blue Sepharose 6 Fast Flow CL-6B、Capto Blue、Capto Blue(high sub)和Affi-Gel Blue，优选AF-Blue HC-650M。