[发明专利]一种鳗鲡嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一两种鳗鲡嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白及其制备方法。

背景技术

近20年来，我国淡水养殖鱼类出现暴发性败血症，给养殖业带来了不可估量的经济损失，研究表明该病的主要病原菌为嗜水气单胞菌和迟顿迟钝爱德华氏菌。嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和迟钝爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）是鳗鲡的重要病原菌，在春夏交替时节能引起鳗鲡出血性败血症、肝肾肿大、烂鳃病、烂尾病等传染性很强的疾病，人工养殖的美洲鳗鲡、欧洲鳗鲡和日本鳗鲡均可发生。水产养殖业长期使用化学药物治疗该病，由于产生耐药性等原因，致使可用的安全药物越来越少。最近可见有关嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌全菌灭活苗和亚单位疫苗相关的研究，但要应用这些研究成果对鳗鲡进行免疫以预防多种病原菌的侵害，需要对鳗鲡进行多次注射操作，对鱼体伤害较大，且操作繁琐。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种可作为疫苗使用的鳗鲡嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白。

本发明的另一目的在于提供该二联重组蛋白的制备方法。

本发明的一技术方案是：

一种鳗鲡嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白，包括连接在一起的嗜水气单胞菌II型孔蛋白膜外部分和迟钝爱德华氏菌ompS2膜外部分，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO1的第271~544位和第1~257位所示。

在本发明的一个优选实施方案中，所述嗜水气单胞菌II型孔蛋白膜外部分和迟钝爱德华氏菌ompS2膜外部分通过一段连接肽连接在一起，该连接肽的序列如SEQ ID NO1的第258~270为所示。

本发明的另一技术方案是：

一种编码所述鳗鲡嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白的基因序列，包括连接在一起的嗜水气单胞菌II型孔蛋白膜外部分的编码核苷酸序列和迟钝爱德华氏菌ompS2膜外部分的编码核苷酸序列，上述编码核苷酸序列分别如SEQ ID NO2的第831~1612位和第1~771位所示。

在本发明的一个优选实施方案中，所述嗜水气单胞菌II型孔蛋白膜外部分的基因序列和迟钝爱德华氏菌ompS2膜外部分的基因序列通过一段如SEQ ID NO2的第772~810位所示的编码一段连接肽的核苷酸序列连接起来。

本发明的再一技术方案是：

一种表达所述鳗鲡嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白的质粒，包括负载有SEQ ID NO2所示核苷酸序列的原核表达载体。

在本发明的一个优选实施方案中，所述原核表达载体为融合表达载体。

本发明的再一技术方案是：

一种表达所述鳗鲡嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白的大肠杆菌，该大肠杆菌转化有负载SEQ ID NO2所示核苷酸序列的原核表达载体。

在本发明的一个优选实施方案中，所述原核表达载体为融合表达载体。

在本发明的一个优选实施方案中，所述原核表达载体为pGEX-2T-His或pGEX-4T-2。

在本发明的一个优选实施方案中，所述用于表达的大肠杆菌为大肠杆菌BL21或大肠杆菌DH5α。

本发明的再一技术方案是：

一种上述鳗鲡嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：

（1）分别扩增编码嗜水气单胞菌II型孔蛋白膜外部分和迟钝爱德华氏菌ompS2膜外部分的基因序列，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO1的第271~544位和第1~257位所示，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO2的第831~1612位和第1~771位所示；

（2）将步骤（1）所得的两个基因序列连接在一起，得到融合基因序列；

（3）将步骤（2）所得的融合基因序列连接到原核表达载体中，构建重组表达载体；

（4）将步骤（3）中所构建的重组表达载体转化到原核宿主细胞中，并在适于表达所述融合基因的条件下培养被转化的原核宿主细胞；

（5）回收并纯化所培养的原核宿主细胞表达的融合蛋白；

（6）对步骤（5）所得的融合蛋白进行复性。

本发明的有益效果是：