[发明专利]促血管生成素1基因修饰的间充质干细胞、及其构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种促血管生成素1基因修饰的间充质干细胞、及其构建方法与应用。

背景技术

急性肺损伤（ALI）和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是临床常见的高发病率、高病死率的疾患，目前全球发病率在8-20人/10万人/年。骨髓源性间充质干细胞在肺损伤和炎症修复中发挥重要作用，是肺损伤修复的重要潜在途径。 但是间充质干细胞修复肺损伤的研究揭示一些问题，如外源性干细胞到达肺部的细胞数稀少、修复水平低，无法达到预期的效果。有研究者采用荧光蛋白示踪间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的研究指出，除去自发荧光、死亡细胞和受污染的血细胞后，甚至检测不到骨髓干细胞在肺内对上皮细胞的有效重建与修复。由此可见，增加MSCs在肺内的驻留及有效修复可能是提高干预效率的关键。

前期研究证实促血管生成素1（angiopoietin 1，Ang1）在肺损伤及许多疾病中起重要作用。Ang1通过激活血管内皮细胞上酪氨酸激酶型受体Tie2 (tyrosine kinase with Ig and EGF homology domains)受体发挥强大作用。多项研究证实Ang1稳定内皮细胞的特异性结构－细胞间粘附连接复合体(adherens junction complexes，AJCs)，抑制炎症因子所致的内皮细胞渗透性增加、减少中性粒细胞粘附于内皮细胞、降低IL-8的分泌，减轻炎症反应及肺损伤。但如何将Ang1回输肺内并使其发挥生物活性，目前并无较好的方法。

研究表明Tie2受体表达在血管内皮上，且以肺内血管的Tie2表达最为丰富。通过Ang1-Tie2间的受体配体结合力（范德华力），Ang1可最大限度地在肺内庞大的血管网内驻留。

综上所述，本领域有必要进一步开发一种方法，使Ang1在MSCs上过表达，从而修饰过的MSCs在经过肺血管网时，高效滞留在肺部，并在此微环境中通过细胞及体液方式修复肺损伤。

发明内容

本发明的目的是提供一种促血管生成素1基因修饰的间充质干细胞。

本发明所提供的促血管生成素1基因修饰的间充质干细胞，是携带有促血管生成素1基因的间充质干细胞。

所述促血管生成素1基因来源于pCR2.1-Ang1质粒，所述间充质干细胞来源于哺乳动物，如小鼠、大鼠、兔子、羊、狗、猪、猴或人等。

本发明的第二个目的是提供一种构建上述促血管生成素1基因修饰的间充质干细胞的方法。

本发明所提供的上述促血管生成素1基因修饰的间充质干细胞的构建方法，可以包括以下步骤：

1）将促血管生成素1基因导入慢病毒包装系统中的目的基因转移载体中，得到携带有促血管生成素1基因的重组慢病毒载体；

2）将携带有促血管生成素1基因的重组慢病毒载体与慢病毒包装系统中的包装质粒和包膜质粒按16-24:5.7-11.7:5.5-10.5的重量份数比混合，转染慢病毒包装细胞，得到携带有促血管生成素1基因的重组慢病毒；

3）将携带有促血管生成素1基因的重组慢病毒转染间充质干细胞，得到过表达促血管生成素1的促血管生成素1基因修饰的间充质干细胞。

在上述步骤中，所述步骤1中优选地，所述促血管生成素1基因来源于pCR2.1-Ang1质粒；获得Ang1基因的方法可以为：从pCR2.1-Ang1质粒中调取Ang1基因，在克隆引物的引导下PCR扩增Ang1基因，然后使用重组酶将PCR产物与经BamHI内切酶酶切后的Age I酶切载体连接，对重组后的Age I酶切载体进行酶切鉴定，琼脂糖电泳检测和基因测序，检测PCR扩增是否获得了序列正确的Ang1基因。

在上述步骤中，所述步骤1中优选地，间充质干细胞来源于哺乳动物，如小鼠、大鼠、兔子、羊、狗、猪、猴或人等。

慢病毒包装系统中的目的基因转移载体优选为pLV质粒，pLV质粒可以表达绿色荧光蛋白（GFP），pLV质粒中含有Ubiqutin启动子，能够在宿主细胞中持续表达GFP。

所述步骤2中，包装质粒可以为pCMV-dR8.74质粒，pCMV-dR8.74质粒中含有HIV 病毒的编码病毒主要的结构蛋白的gag 基因，编码病毒特异性的酶的pol基因，和编码调节gag 和pol 基因表达的调节因子rev基因；包膜质粒可以为pMD2G，pMD2G质粒中含有单纯疱疹病毒来源的VSVg 基因，提供病毒包装所需要的衣壳蛋白；慢病毒包装细胞可以为293T细胞。