[发明专利]一种大规模培养树突状细胞疫苗的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种大规模培养树突状细胞疫苗的制备方法。本发明涉及的采用血细胞分离机通过采集人外周血中白细胞，经体外分离纯化获得大量的单个核细胞。获得的单个核细胞能简便地获得大量的树突状细胞，其高表达共刺激分子，具有激活机体效应性T淋巴细胞的功能，可用于各类癌症包括实体瘤和血液肿瘤在内的多个疗程的免疫治疗。 

背景技术

细胞免疫治疗癌症在临床已得到广泛的应用，其无放化疗带来的巨大毒副作用，达到了相对安全，提高了患者生活品质，有尊严的治疗方式。树突状细胞是机体内最大的抗原呈递细胞，机体效应性T淋巴细胞，而杀死肿瘤细胞。树突状细胞疫苗多疗程治疗对患者疗效和生存期有着明显的帮助，并得到临床上认可。 

目前，获得树突状细胞的来源主要为从患者外周血中分离出单个核细胞，而采集患者外周血是有限的，一般为50毫升到300毫升，从而得到的树突状细胞仅为0.5-3×10⁷个，仅满足一个疗程2-6次治疗，很大程度上影响了给患者的治疗，而且多疗程治疗时需要再次采血，给予患者很大的精神压力。 

本发明通过血细胞分离机循环采集人外周血中白细胞，经体外纯化获得大量的单个核细胞，简便地获得大量的未成熟树突状细胞，将未成熟树突状细胞冷冻保存起来。每次治疗时复苏一部分未成熟树突状细胞进行负载肿瘤抗原和诱导成熟，获得特异的树突状细胞疫苗。这样不仅可以满足多疗程树突状细胞疫苗免疫治疗，持续发挥树突状细胞的免疫功能，有助于提高临床疗效和延长患者生存期，而且血细胞分离机采集属于白细胞成分采集，来自患者的血细胞、血小板和血浆仍返回患者体内，不会对患者造成重大健康影响。 

发明内容

现有技术主要通过从患者中采集有限量的外周血，一般为50毫升到300毫升，通过体外诱导获得树突状细胞的数量也是有限的，仅为0.5-3×10⁷个细胞。若一次树突状细胞疫苗治疗至少使用0.5×10⁷个细胞，最多能满足6次的治疗，1个疗程一般为4-5次，因而最多可以进行1.5个疗程治疗。 

树突状细胞能激活机体效应T细胞，对外源性快速增殖的肿瘤细胞进行杀伤。就犹如疫苗一样，树突状细胞需要持续地进行加强，维持对机体“非我”的肿瘤细胞进行杀伤，有效地抑制肿瘤细胞的复发和转移。因而树突状细胞疫苗在临床应用中需要进行多次多疗程治疗，更好地提高患者临床疗效和延长生存期。通过现有技术获得的树突状细胞数量，没法完成患者的多次多疗程的治疗和保证患者的长期疗效。血细胞分离机采集属于白细胞成分采集，来自患者的血细胞、血小板和血浆仍返回到患者体内，不会对患者造成重大健康影响。本发明技术通过血细胞分离机循环采集人外周血中白细胞，经体外纯化获得大量的单个核细胞，数量级可大于0.8×10⁹，简便地获得大量的未成熟树突状细胞，数量级可大于8×10⁷，将未成熟树突状细胞冷冻保存起来。每次治疗时吸取或复苏6×10⁶未成熟树突状细胞进行负载肿瘤抗原和诱导成熟，获得特异的树突状细胞疫苗，可用于多达13次以上、3个疗程以上的临床应用。 

本发明涉及一种大规模培养树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下工序：采用血细胞分离机通过采集人外周血中白细胞，经体外分离纯化获得大量的单个核细胞，在人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白介素4诱导培养获得大量未成熟树突状细胞；未成熟树突状细胞负载肿瘤特异抗原后，并在肿瘤坏死因子α与脂多糖诱导培养条件下获得具有抗肿瘤作用的成熟树突状细胞疫苗。 

采用血细胞分离机进行循环0.5L-4L人外周血，采集白细胞，数量级可达到1×10⁹-3.5×10¹⁰；采集的白细胞进行体外分离纯化，去除红细胞、血小板和粒细胞等，获得单个核细胞，数量级可达到0.8×10⁹-2.8×10¹⁰。 

优选地，本发明所述方法为：根据血常规检测结果要求大于2.0×10⁹个白细胞/升，采用血细胞分离机进行循环1L人外周血，采集白细胞，数量级可达到2×10⁹；采集的白细胞进行体外分离纯化，去除红细胞、血小板和粒细胞 等，获得单个核细胞，数量级可达到1.6×10⁹。