[发明专利]一种大规模培养树突状细胞疫苗的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种大规模培养树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下工序：采用血细胞分离机通过采集人外周血中白细胞，经体外分离纯化获得大量的单个核细胞，在人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白介素4诱导培养获得大量未成熟树突状细胞；未成熟树突状细胞负载肿瘤特异抗原后，并在肿瘤坏死因子α与脂多糖诱导培养条件下获得具有抗肿瘤作用的成熟树突状细胞疫苗；将所述的树突状细胞疫苗进行细胞活率和细胞表型检测，细胞活率达到98％以上；其高表达共刺激分子CD80、CD83和CD86；

所述树突状细胞疫苗满足在临床抗肿瘤治疗中多次多疗程的应用。

2.一种大规模培养树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于，采用血细胞分离机进行循环0.5L-4L人外周血，采集白细胞，数量级可达到1×10⁹-3.5×10¹⁰；采集的白细胞进行体外分离纯化，去除红细胞、血小板和粒细胞，获得单个核细胞，数量级可达到0.8×10⁹-2.8×10¹⁰；

血细胞分离机采集经纯化后的1.6×10⁹单个核细胞用RPMI 1640培养基重悬，苔盼兰染色计数，使用RPMI1640培养基调整到细胞浓度为3-5×10⁶/mL，并加入多层细胞培养器中贴壁；在37℃、5％CO₂培养箱中孵育90min后，未贴壁细胞洗涤收集下来；贴壁细胞加入培养基诱导培养，该培养基含有200ng/mL GM-CSF、50ng/mL IL-4和5％的自体血清；于37℃、5％CO₂培养箱中培养；在培养到第三天时1000rpm离心10分钟收集细胞，半量更换新鲜RPMI1640培养基，该新鲜培养基含200ng/mL GM-CSF、50ng/mL IL-4和体积比5％自体血清；培养到第五天收获未成熟树突状细胞；获得未成熟树突状细胞苔盼兰计数，数量级可大于12.8×10⁷；将所述的未成熟树突状细胞冻存起来，6×10⁶个未成熟树突状细胞冻存1毫升，冻存管放置程序降温盒中，放入-80℃超低温冰箱过夜，第二天转至液氮冻存；

每次吸取或复苏6×10⁶个未成熟树突状细胞，然后用RPMI1640培养基-稀释到细胞浓度2.5×10⁶/mL，并添加0.1mL的1×10⁶肿瘤全细胞抗原或50ng/mL肿瘤特异表达抗原多肽，负载于树突状细胞，于37℃、5％CO₂培养箱中孵育2小时；孵育后添加10ng/mL肿瘤坏死因子α、10ug/mL脂多糖，培养到第7天收获树突状细胞疫苗；

将所述的树突状细胞疫苗进行细胞活率和细胞表型检测，细胞活率达到98％以上；其高表达共刺激分子CD80、CD83和CD86；其中，CD80+/HLA-DR+细胞为大于90％，CD86+/CD11c细胞为大于80％，CD83+/CD11c+细胞为大于65％；

所述树突状细胞疫苗满足在临床抗肿瘤治疗中多次多疗程的应用。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，优选的细胞活率检测方法为：计算培养最后一天的活细胞数；取1mL最后一天培养的培养液，1000rpm、4℃下离心10分钟，细胞用培养基重悬，取20ul细胞液用1×PBS稀释20倍，稀释液加入1倍体积的苔盼兰溶液，混匀后加入到细胞计数板，于倒置显微镜下观察计数，蓝色染色的为死细胞，不染色的为活细胞，细胞活率达到98％以上。