[发明专利]一种莱克多巴胺单克隆抗体的制备方法

权利要求书

1.一种莱克多巴胺单克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

A）制备完全抗原RAC-BSA和包被原RAC-OVA：（a）将莱克多巴胺，即RAC溶解在四氢呋喃水溶液中，先后加入苯甲氧羰琥珀酰亚胺和碳酸氢钠，搅拌12小时后用乙酸乙酯萃取，取有机相减压除去溶剂，过硅胶层析柱，收集中间产物A；（b）将所述中间产物A溶解在二氯甲烷中，冷却至0℃，加入三乙胺和叔丁基二甲基氯硅烷，升至室温反应12h后加水，再用二氯甲烷萃取，取有机相减压除去溶剂，得到化合物B；（c）将所述化合物B溶解在二氯甲烷中，冷却至-10℃，先后加入三苯基膦、咪唑和N-溴代丁二酰亚胺，搅拌30min后加入饱和氯化铵溶液，再用二氯甲烷萃取，取有机相减压除去溶剂，得到化合物C；（d）将6-羟基己烷甲酸甲酯溶解在N，N-二甲基甲酰胺中，冷却至0℃，加入NaH，搅拌10min，得到混合液，将所述化合物C溶解在N，N-二甲基甲酰胺中，再加入到所述混合液中，搅拌10h后减压除去N，N-二甲基甲酰胺，用乙酸乙酯萃取，取有机相减压除去溶剂，得到化合物D；（e）将所述化合物D溶解在甲醇水溶液中，冷却至0℃，加入LiOH，反应1h后减压除去甲醇，用HCl调节pH至3，用乙酸乙酯萃取，取有机相减压除去溶剂，得到化合物E；（f）将所述化合物E溶解在甲醇中，加入催化量的Pd/C，密闭反应体系，用氢气换气3次，反应1h后过滤Pd/C，减压除去甲醇，得化合物F；（g）将所述化合物F溶解在四氢呋喃中，冷却至0℃，加入四丁基氟化铵，反应2h后减压除去四氢呋喃，过柱提纯产品，得到化合物G；（h）将所述化合物G溶解在N，N-二甲基甲酰胺中，冷却至0℃，加入三乙胺和牛血清白蛋白，即BSA，待BSA完全溶解后加入二环己基碳二亚胺，搅拌24h，减压除去N，N-二甲基甲酰胺，先后用水和乙醇洗涤，得到固体产物即为RAC-BSA；（i）将所述化合物G溶解在N，N-二甲基甲酰胺中，冷却至0℃，加入三乙胺和卵清蛋白，即OVA，待OVA完全溶解后加入二环己基碳二亚胺，搅拌24h，减压除去N，N-二甲基甲酰胺，先后用水和乙醇洗涤，得到固体产物即为RAC-OVA；

B）动物免疫：采用Balb/c小鼠作为免疫动物，所述RAC-BSA与等体积弗氏完全佐剂乳化后作为第一次免疫原，所述RAC-BSA与等体积快速鼠单抗制备佐剂乳化后作为第二、三、四次免疫原，每次免疫剂量为25~50ug/只小鼠，共免疫四次；

C）冲击免疫：所述第四次免疫结束后10~15天，用间接ELISA法测血清抗体效价，选取所述血清效价高的小鼠进行冲击免疫，所述冲击免疫的剂量为50~100ug/只；

D）制备杂交瘤细胞：所述冲击免疫结束后三天，取接受过冲击免疫的小鼠的脾细胞，以PEG4000作融合剂，将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞按数量比为5：1进行细胞融合，选取阳性克隆进行亚克隆，得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

E）制备腹水并纯化莱克多巴胺单克隆抗体：用灭菌石蜡致敏Balb/c小鼠，所述致敏结束7天后分别对每组小鼠腹腔注射所述杂交瘤细胞，7~10天后采集腹水，采用饱和硫酸铵法纯化腹水，再用DEAE弱阴离子交换树脂进一步纯化，得到纯化后的单克隆抗体，即莱克多巴胺单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的一种莱克多巴胺单克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤A）中所述制备完全抗原RAC-BSA和包被原RAC-OVA是采用醚化反应将莱克多巴胺苄醇基团的羟基连接上6-羟基己烷甲酸甲酯制备半抗原，再经过缩合反应制得莱克多巴胺与载体蛋白复合物。

3.根据权利要求1所述的一种莱克多巴胺单克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤B）中所述Balb/c小鼠为8~12周鼠龄的健康雄性Balb/c小鼠。

4.根据权利要求1所述的一种莱克多巴胺单克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤B）中所述第二、三、四次免疫的时间分别是所述第一次免疫后的第30、50、65天。

5.根据权利要求1所述的一种莱克多巴胺单克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤C）中所述冲击免疫的免疫原是RAC-BSA。

6.根据权利要求1所述的一种莱克多巴胺单克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤D）中所述PEG4000融合剂为预热至42℃的质量分数为50% PEG4000。

7.根据权利要求1所述的一种莱克多巴胺单克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤E）中所述Balb/c小鼠为生育一次的雌性青年小鼠。