[发明专利]一种人胆管癌多药耐药细胞建立的新方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种多药耐药细胞建立的新方法，尤其涉及一种人胆管癌多药耐药细胞建立的新方法。

背景技术

恶性肿瘤是目前危害人类健康的主要疾病指引，其死亡率仅次于心脑血管疾病。目前全世界每年恶性肿瘤的新发病例超过1000万。在我国，每年新发病例160万，死亡140万。胆管癌以前曾经被认为是一种少见疾病，但是随着各种新的诊断技术的不断出现，其发病率逐年上升，已经成为消化道肿瘤中上升速度最快的肿瘤之一。目前国内的发病率为0.1‰-0.73‰，发病年龄多在50-70岁，男女比例约为1.4:1，而国外尸检发现率为0.01%-0.5%。根据Mouzas IA等调查发现：从1992年到2000年的9年时间里，胆管癌的发病率从0.998/10万→2.329/10万→3.327/10万人，渐呈上升趋势。

胆管癌早期发现率低，大多数患者发现时已失去手术机会，而且手术切除率较低，一般为50%左右，，除了少数的早期病变之外，一般很难通过手术达到根治性切。随着科学技术的发展，虽然手术切除治疗上虽然得到较大的进展，手术切除率已明显提高，手术死亡率也明显下降，手术方法亦日趋规范化，但存在的困难仍然很多，由于真正能达到根治性切除的病例很少，肿瘤复发常常是难以避免的。远期效果仍不佳，需有新的突破。现有的化学药物治疗未见有明显的效果，而且在化疗过程中易出现耐药。放射治疗尽管部分病人能延长生存时间，但仍然很难提高病人的生活质量。

目前尚缺乏早期诊断胆管癌的手段，对胆管癌的发病机制的了解也不够深入。进一步提高对胆管癌病因、发病机理、早期诊断以及相应的治疗方法的认识，对于延长患者生命，改善患者生活质量，甚至治愈胆管癌有重要意义。因此，通过对建立的胆管癌细胞系的进一步研究势在必行。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人胆管癌多药耐药细胞建立的新方法，建立胆管癌耐药细胞株。

本发明的一种人胆管癌多药耐药细胞建立的新方法包括以下步骤：

1）将胆管癌细胞株QBC939放入含表皮生长因子浓度为5-15μg/ml，药物浓度为0.0005-0.002 μg/ml的培养液中培养2-4天；

2）弃去药物培养液，将步骤1）处理后的管癌细胞株QBC939放入含表皮生长因子5-15μg/ml，药物浓度增加的培养液中培养2-4天；

3）重复步骤2），直到药物浓度为0.25-0.3 μg/ml；

4）弃去药物培养液，将步骤3）处理后的管癌细胞株QBC939放入含表皮生长因子5-15μg/ml，药物浓度降低的培养液中培养2-4天；

5）弃去药物培养液，将步骤4）处理后的管癌细胞株QBC939放入含表皮生长因子5-15μg/ml，药物浓度增加的培养液中培养2-4天；

6）重复步骤5），直到药物浓度比步骤3）的药物浓度高0.1-1μg/ml；

7）重复步骤4）、步骤5）和步骤6），每次重复后药物浓度均比上一次重复后的药物浓度高0.1-1 μg/ml，直到药物浓度为0.8-1.5 μg/ml为止。

上述步骤中，优选地，增加药物浓度每次增加0.004-0.25 μg/ml，降低药物浓度每次降低0.1-0.25 μg/ml。

优选地，胆管癌细胞株在培养液中每次培养3天。

优选地，所述表皮生长因子的浓度为10 μg/ml。

所述药物可以为氮芥、环磷酰胺、博莱霉素、长春新碱、平阳霉素、优福啶、哺氟啶或多柔比星等中的任意一种或几种。

本发明的一种人胆管癌多药耐药细胞建立的新方法采用药物浓度递增结合高低浓度交替作用合并生长因子刺激法，能提高培养效率，相对于药物浓度递增刺激法，在较短时间内就能建立胆管癌耐药细胞株，可用于分析得到胆管癌细胞化疗耐药后的形态学及生物学习性的变化，筛选得到的化疗药物及判断得出化疗药物的敏感性，分析得到的肿瘤化疗多药耐药机制，体外筛选得到的耐药逆转剂更具有代表性、针对性、可靠性和广谱性。    

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明所述的一种人胆管癌多药耐药细胞建立的新方法进行详细的介绍和描述，以更好的理解本发明，但是应当理解的是，下述实施例并不限制本发明范围。

本实施例中采用药物多柔比星（ADM），依照本发明的方法，建立胆管癌耐药细胞株QBC939/ADM，具体包括以下步骤：