[发明专利]一种检测禽流感病毒的实时荧光RT-HDA试剂盒及引物

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测禽流感病毒的实时荧光RT-HDA试剂盒及引物，属于检验检疫领域。

背景技术

禽流感（Avian Influenza，AI）是由正黏病毒科、流感病毒属、A型流感病毒引起的禽类感染和/或疾病综合症。禽流感历史悠久，第一次发现是1878年，Perroncito首次报道禽流感在意大利发生，已被国际兽医局（OIE）列为A类烈性传染病，世界卫生组织(WHO)认为AI是对人类造成潜在威胁的最主要的疾病之一，我国也将高致病性禽流感（HPAI）列入一类动物传染病进行防制。近些年来，我国很多地区都存在禽流感的流行，给养禽业带来不同程度的打击，迄今为止已经发生多起高致病性禽流感感染人致死的事件，对养殖业发展和人类健康造成巨大威胁。目前，全世界已有15个国家和地区发现禽流感人类感染病例，死亡率高达60%以上。因此，建立禽流感快速检测技术，将对禽流感的监测与防控发挥重要作用。

目前，我国使用的禽流感检测标准有2项行标和7项国标，主要检测方法有病毒分离、各类血清学试验及免疫学试验（琼扩、血凝血抑、ELISA）、分子生物学检测方法（RT-PCR和荧光RT-PCR）等。但是，每种检测方法均存在一定的局限性。传统的病毒分离和血清学方法繁琐耗时，不适于流行病学普查和高通量口岸检疫。PCR和荧光PCR方法已经得到广泛应用，并在疾病检测和过境检疫中发挥了重要作用。但是，传统的PCR技术仍然存在一些不足：需要昂贵的设备，尤其是荧光PCR仪造价不菲；容易受到多种因素的影响；扩增时间往往需要几个小时。上述问题使得传统的PCR技术难以在基层推广应用，不利于疾病的“早发现、早报告、早处理”。

近年来，分子诊断技术日新月异，产生了多种新型分子扩增技术，推动着分子诊断技术向操作简单、仪器要求不高的方向发展。其中，依赖解旋酶恒温基因扩增技术（Helicase-Dependent Isothermal Amplification，HDA）是2004年BioHelix的研究人员模拟动物体内DNA的复制机制发明的一种新的体外恒温扩增技术。该技术利用DNA双链解旋酶打开双链DNA，同时在单链结合蛋白（SSB）和DNA聚合酶的作用下，扩增靶片段，实现目的基因的体外扩增。此外，实时荧光定量检测病原技术是近些年来应用越来越广泛的一种检测方法。使用SyberGreen荧光染料，结合溶解曲线的分析，可对荧光PCR进行实时定量检测。若将荧光定量方法与HDA技术结合，建立实时荧光RT-HDA方法，则能将两种技术的优势发挥至最大。

实时荧光RT-HDA技术的优势：

1.HDA技术与普通PCR技术相比，具有很多优势。HDA技术的引物设计比较简单易学，由于是恒温扩增技术，不论检测何种病原均可使用同一种反应温度，因此，即可在同一条件下分管同时检测不同的病原，也可建立多重HDA方法同时检测多种病原，不需要特意将不同扩增片段的退火温度设计成一样。此外，由于体系中使用了耐高温的BstDNA扩增酶，使得HDA技术具有更高的特异性和敏感性。HDA技术与其他恒温扩增技术相比，是一种真正的恒温扩增方法，完全不需95℃变性，因而，该技术不需要PCR仪，操作简单方便，非常适合基层检测和现场快速诊断。

2.本发明使用EvaGreen作为实时定量HDA方法中的DNA结合染料。EvaGreen是一种可结合于双链DNA小沟中的荧光染料，与双链DNA结合后，其荧光大大增强，这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。该染料的诸多优点使它远胜于目前常用的SYBRGreen Ⅰ。除了有相似的光谱特性，EvaGreen有三个主要特点使它区别于SYBRGreen Ⅰ：①EvaGreen对PCR的抑制性远小于SYBRGreen Ⅰ，因此，使用EvaGreen进行的qPCR实验可以使用快速PCR步骤。同时，EvaGreen在实验中可以使用较高的浓度，从而获得远强于SYBRGreen Ⅰ的扩增信号。较高浓度的EvaGreen也消除了“染料重分布”的缺陷，使EvaGreen既可用于多重PCR，也可用于高分辨率（高清晰）熔解曲线分析（HRM）。②EvaGreen的稳定性极强。在正常的储存、操作和PCR过程中不会被破坏。在缓冲溶液中的染料可以安全的储存在室温或冰箱里，也可以反复冻融。与之相反，SYBRGreen Ⅰ不稳定而且降解后对PCR的抑制性更强。③EvaGreen降低了细胞膜透性，因而比SYBRGreen Ⅰ更加安全。独立实验室的测试结果显示，EvaGreen既没有诱变性也没有细胞毒性，更符合生物安全要求。