[发明专利]一种检测禽流感病毒的实时荧光RT-HDA试剂盒及引物

权利要求书

1.一组检测禽流感病毒的引物，其特征在于，该引物序列如序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：2所示，其中SEQ ID NO：1为检测禽流感病毒的引物I，SEQ ID NO：2为检测禽流感病毒的引物II。

2.一种检测禽流感病毒的实时荧光RT-HDA试剂盒，其特征在于，由以下组分组成：

（1）TriZol裂解液；

（2）RT-HDA反应液，其包括：HDA缓冲液、MgSO₄、NaCl、dNTP、引物I、引物II；其中，所述引物I的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，引物II的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示；

（3）酶混合物，其包括：DNA解旋酶，Bst DNA扩增酶和反转录酶；

（4）荧光染料：包括EvaGreenDye和Rox Reference Dye；

（5）无RNA酶的灭菌纯化水；

（6）阴性对照：无核酸灭菌水；

（7）阳性对照：为体外转录的非感染性RNA片段，其对应的DNA序列为序列表SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的实时荧光RT-HDA试剂盒，其特征在于：所述反转录酶为ThermoScript反转录酶。

4.根据权利要求2所述的实时荧光RT-HDA试剂盒，其特征在于：所述RT-HDA反应液为1×HDA缓冲液、3.5mM MgSO₄、40mM NaCl、0.21mM dNTP、100nM引物I和100nM引物II。

5.一种检测禽流感病毒的PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）提取样品RNA；

（2）对提取的样品RNA进行实时荧光RT-HDA扩增；

（3）反应条件：

第一步：66℃，5s；65℃，1min55s（收集荧光）；40~60个循环；

第二步：溶解曲线分析，使用荧光PCR仪默认程序；

（4）结果描述及判定

①质控标准，阴性对照无Ct值并且无扩增曲线；

②阳性对照的Ct值应≤35.0，并出现特定的S型扩增曲线，且溶解曲线出现单一峰值，并且单一峰在退火温度附近，如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效；

③结果描述及判定

阳性：Ct值≤35.0，并出现特定的S型扩增曲线，且溶解曲线出现单一峰值，并且单一峰在退火温度附近，表示样本中存在禽流感病毒；

阴性：无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无禽流感病毒。