[发明专利]一种菊酯类农药降解酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及农药降解酶的制备方法技术领域，尤其涉及一种菊酯类农药降解酶的制备方法。

背景技术

菊酯类农药是广谱性杀虫剂，具有速效、高效、低毒、低残留的特点，对140多种害虫的防治有特效。然而，用农药对农作物进行害虫防治时将使农作物的表面或多或少残留一些农药，尤其是菊酯类农药降解速度慢，不仅对人体健康造成危害，而且对生态系统也造成一定的影响。为此，人们采用微生物对农药进行降解，而微生物对农药的作用方式多样，多数属于通过酶促反应降解农药。

中山大学的刘玉焕等通过（一种新型酯酶及其应用，ZL201010547206.8）中的高通量功能筛选的方法克隆了Klebsiella sp.ZD112中具有菊酯类农药降解能力的新基因est825，构建了重组表达的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-est825，酶学性质研究发现，通过此重组大肠杆菌生产的重组酶在常温下对氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯的降解率分别达到80.82%，82.98%，69.23%和69.65%，菊酯类农药降解酶降解效率高、安全无毒、环境适应强，具有良好的应用前景。

目前，国内外已出现通过构建基因组文库克隆一个菊酯类农药降解酶的新基因，并构建能高效表达该基因的工程菌等相关研究，如山东农业大学的闫艳春等（一种工程菌的高酶活及其固定化细胞对农药的降解，中国环境科学，1999,19(5)）将抗性尖音库蚊五带亚种的抗有机磷农药基因克隆到质粒pRL-439中，获得高酶活工程菌，表达的酶对两类难降解农药（有机氯、菊酯类）可降解90%以上，但未提及产酶量；中国科学院动物研究所的乔传令等（一种超级工程菌及其表达的解毒酶和其构建方法及应用，ZL200410042712.6）分别克隆解毒酯酶和水解酶基因，将此基因分别克隆到表达载体pETDuet-1上，构建融合表达载体pETDuet-b1-opd，最后转化得到重组菌株并进行诱导培养，该超级工程菌和解毒酶可以同时降解马拉硫磷、对硫磷、高效氯氰菊酯、三氯杀虫酯等有机酸酯和有机磷类农药，但未提及降解率及产酶量；Heidari Rama等（Hydrolysis of pyrethroids by carboxylesterases from Lucilia cuprina and Drosophila melanogaster with active sites modified by in vitro mutagenesis, Insect Biochemistry and Molecular Biology，2005,35(6):597~609）通过基因突变技术改变来源于绿蝇与家蝇的羧酸酯酶的活性位点，使得该酶对顺、反式菊酯类农药的降解能力比野生的提高很多倍，而且突变位点不同，也会影响其对顺、反式菊酯类农药的降解能力。Stok Jeanette E等（Identification, expression, and purification of a pyrethroid-hydrolyzing carboxylesterase from mouse liver microsomes, Journal of Biological Chemistry, 279(28):29863~29869）从小鼠肝微粒中克隆了1个能降解菊酯类农药的羧酸酯酶基因，并在杆状病毒中表达、纯化，还研究该酶对顺、反式菊酯类农药的催化常数，又从小鼠的肝微粒cDNA文库中筛选分离第2个水解菊酯类农药的羧酸酯酶基因。

然而，目前国内外暂缺有关采用基因工程菌高密度发酵技术高效生产菊酯类农药降解酶的技术，因此本领域迫切需要开发高产菊酯类农药降解酶的方法。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种菊酯类农药降解酶的制备方法，该制备方法利用重组大肠杆菌高效生产菊酯类农药降解酶。

本发明是通过以下技术来实现的。

一种菊酯类农药降解酶的制备方法，包括以下步骤：

1）以重组大肠杆菌{E.coli BL21(DE3)/pET-28a-est825}作为生产菌种，用甘油管将生产菌种在-86℃的温度下保存；

2）种子培养：将甘油管中的生产菌种按2~4%的接种量接入摇瓶种子培养基，以转速为200~220r/min、温度为37℃、培养时间为8~10h的培养条件在恒温摇床中培养；在重组大肠杆菌的发酵过程中，质粒稳定性对产物表达非常重要，在较高的温度如37℃下，重组大肠杆菌的质粒稳定性较高。