[发明专利]一种菊酯类农药降解酶的制备方法

权利要求书

1.一种菊酯类农药降解酶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）以重组大肠杆菌{E.coli BL21(DE3)/pET-28a-est825}作为生产菌种，用甘油管将生产菌种在-86℃的温度下保存；

2）种子培养：将甘油管中的生产菌种按2~4%的接种量接入摇瓶种子培养基，以转速为200~220r/min、温度为37℃、培养时间为8~10h的培养条件在恒温摇床中培养；

 3）发酵培养：将培养好的种子液以2~5%的接种量接入装有3.75~4.5L发酵培养基的7.5L发酵罐中进行发酵培养，发酵培养的时间为24~28h，在发酵过程中通过通入无菌空气和改变搅拌转速来控制发酵液溶氧值维持在20%~25%；

4）补料发酵培养：发酵培养4~6h后，流加甘油和酵母粉的混合补料液，控制菌体的比生长速率为0.1~0.2h^-1，补料发酵培养阶段持续的时间为10~14h；

5）乳糖诱导：补料发酵培养至菌体的OD_600nm值达到100~140时，一次性添加乳糖溶液，使发酵液乳糖的浓度为5~8g/L，将温度降至30~35℃开始诱导，诱导过程中继续流加步骤4）中的混合补料液，维持发酵液中甘油的浓度为1~2g/L，乳糖诱导的时间持续8~10h；

6）酶粉制备：发酵结束后，在4~8℃的温度下离心收集菌体，将菌体用pH6.5~7.0的磷酸盐缓冲液配制成质量浓度15%~20%的菌悬液，将菌悬液在4℃的温度下、150Mpa的压力下高压破碎得到破碎液，将破碎液在4℃的温度下进行高速离心制得上清液，或用低温微膜过滤制得过滤液，再将上清液或过滤液真空冷冻干燥即制得酶粉。

2.根据权利要求1所述的一种菊酯类农药降解酶的制备方法，其特征在于：所述步骤2）中，所述摇瓶种子培养基的pH为7.0，所述摇瓶种子培养基包括以下组分：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，卡那霉素50~100mg/L。

3.根据权利要求1所述的一种菊酯类农药降解酶的制备方法，其特征在于：所述步骤3）中，所述发酵培养基的pH为 6.8，所述发酵培养基包括以下组分：甘油5~8g/L，蛋白胨3~10g/L，酵母粉3~8g/L，(NH₄)₂SO₄ 5~10g/L，MgSO₄·7H₂O 1~3g/L，KH₂PO₄ 3.4~6.85g/L，K₂HPO₄·12H₂O 5.68~11.35g/L，微量元素液1~2mL/L，卡那霉素50~100mg/L。

4.根据权利要求3所述的一种菊酯类农药降解酶的制备方法，其特征在于：所述微量元素液包括以下组分：CaCl₂ 2.0g/L，ZnSO₄·7H₂O 5.0g/L，MnSO₄·H₂O 0.5g/L，Na₂-EDTA 18.0g/L，FeSO₄·7H₂O 10.0g/L，CuSO₄·5H₂O 2.5g/L，CoCl₂·6H₂O 0.2g/L，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.1g/L。

5.根据权利要求4所述的一种菊酯类农药降解酶的制备方法，其特征在于：所述微量元素液为经溶于无菌水中，再用0.22μm的滤膜过滤除菌后的微量元素液。

6.根据权利要求1所述的一种菊酯类农药降解酶的制备方法，其特征在于：所述步骤3）具体为：发酵培养：将培养好的种子液以2~5%的接种量接入装有3.75~4.5L发酵培养基的7.5L发酵罐中进行发酵培养，发酵培养的时间为24~28h，并在发酵过程中通过通入无菌空气和改变搅拌转速来控制发酵液溶氧值维持在20%~25%，通气量为0.5~4vvm，搅拌转速200~1000r/min，培养温度37℃，流加20%~25%的氨水和3mol/L的盐酸溶液控制发酵液的pH为6.8~7.0。

7.根据权利要求1所述的一种菊酯类农药降解酶的制备方法，其特征在于：所述步骤4）中，所述甘油和酵母粉的混合补料液包括以下组分：甘油300~500g/L，酵母粉60~100g/L，卡那霉素50~100mg/L。