[发明专利]肺炎支原体P1-RFLP分型检测引物及方法

说明书

技术领域

本发明属于生物、医药领域，具体地涉及一种肺炎支原体P1-RFLP分型检测引物及方法。

背景技术

肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，Mp)是社区获得性呼吸道感染的重要致病菌之一，其感染后的临床表现可以从轻度的咽喉炎、支气管炎到重症间质性肺炎(原发性非典型肺炎)及神经系统、心血管系统并发症等。Mp流行具有周期性，每3-7年在不同地区出现发病率高峰。儿童肺炎中10-30％的病例是Mp引起的，在流行高峰年Mp肺炎可高达30-50％，且流行可持续1-2年。进入21世纪以来，全球性的Mp感染暴发流行已出现了两次，分别在2005-2007年和2010-2012年初发生。Mp感染暴发流行对家庭、学校、部队、社会都会产生较大的经济损失和社会不良影响。

P1基因作为一种重要的毒力因子，其编码的产物是P1蛋白，是Mp的主要黏附素及毒力因子，并能作为一种重要的免疫原刺激机体产生强烈的免疫应答。在P1结构基因中包含有RepMP2/3和RepMP4，这些重复序列在Mp的进化上起重要作用，不同位置的重复序列会发生基因的重组或置换。根据不同菌株P1基因上RepMP重复序列的多态性，采用PCR-RFLP可以将其分为以国际标准株M129为代表的P1-Ⅰ和以国际标准株FH为代表的P1-Ⅱ两型。P1基因在国际标准株M129中位于Mp基因组的第180858-185741位，由4884个碱基组成，在国际标准株FH株中位于179293-184197位，由4905个碱基组成。

现有此种分型方法采用PCR扩增P1基因的RepMP2/3和RepMP4，扩增产物分别为2532bp及2201bp，然后对这些扩增产物用HaeIII内切酶进行酶切，根据酶切产物图谱的不同来判断不同的型别。由于此方法扩增的产物较长，对标本DNA的质量要求较高，通常适用于肺炎支原体菌株的检测，由于肺炎支原体很难分离培养，且时间较长，临床标本中DNA的含量通常较少又含有较多的抑制物，因此急需一种新的能够适用于临床标本及菌株直接检测的分型方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种肺炎支原体P1-RFLP分型检测引物和方法，分别对RepMP2/3和RepMP4序列设计4条内套引物，通过扩增较短片段，可直接对肺炎支原体感染标本进行基因分型，以解决目前肺炎支原体P1-RFLP基因分型扩增片段较长，不易被扩增，费时、费力且不能在临床上大规模检测的问题。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种肺炎支原体P1-RFLP分型检测引物，分析两个已知的Mp标准株M129(1型)和FH(2型)P1基因RepMP4和RepMP2/3序列，在序列的中间部位包含HaeIII酶切位点(GGCC)区域设计8条内套引物，RepMP4序列的4条内套引物为上游引物ADH1in：ATTCTCATCCTCACCGCCA，下游引物ADH1M：CCTTGGGATCCAAGTGATCA以及上游引物ADH2M：TGATCACTTGGATCCCAAGG，下游引物ADH2in：CTGCTAACAATTCCGGATTGAG；RepMP2/3序列的4条内套引物为上游引物ADH3in：TTGCTGCTAACGAGTACGAG，下游引物ADH3M：CAAATCCCACACACTCTCCA以及下游引物ADH4in：TGACTGATACCTGTGCGG，上游引物ADH4M：TGGAGAGTGTGTGGGATTTG。

本发明还提供一种肺炎支原体P1-RFLP分型检测方法，具体包括如下步骤：

(1)提取待测样本DNA；

(2)首先利用目前已发表的2对外套引物ADH1及ADH2、ADH3及ADH4，样本DNA及其它PCR组份构建PCR反应体系进行扩增，所述2对外套引物的序列分别为ADH1：CTGCCTTGTCCAAGTCCACT；ADH2：AACCTTGTCGGGAAGAGCTG；ADH3：CGAGTTTGCTGCTAACGAGT；ADH4：CTTGACTGATACCTGTGCGG；其次利用上述设计的八条内套引物、外套引物扩增后的产物DNA及其它PCR组份构建PCR反应体系进行内套引物扩增，其中外套引物物ADH1/ADH2扩增后的DNA，作为内套引物ADH1in/ADH1m和ADH2m/ADH2in的扩增模板，外套引物ADH3/ADH4扩增后的DNA，作为内套引物ADH3in/ADH3m和ADH4m/ADH4in的扩增模板，。