[发明专利]肺炎支原体P1-RFLP分型检测引物及方法

权利要求书

1.一种肺炎支原体P1-RFLP分型检测引物，分析两个已知的Mp标准株M129和FH P1基因RepMP4和RepMP2/3序列，在序列的中间部位包含HaeIII酶切位点区域设计8条内套引物，其特征在于RepMP4序列的4条内套引物为上游引物ADH1in：ATTCTCATCCTCACCGCCA，下游引物ADH1M：CCTTGGGATCCAAGTGATCA以及上游引物ADH2M：TGATCACTTGGATCCCAAGG，下游引物ADH2in：CTGCTAACAATTCCGGATTGAG；RepMP2/3序列的4条内套引物为上游引物ADH3in：TTGCTGCTAACGAGTACGAG，下游引物ADH3M：CAAATCCCACACACTCTCCA以及下游引物ADH4in：TGACTGATACCTGTGCGG，上游引物ADH4M：TGGAGAGTGTGTGGGATTTG。

2.一种肺炎支原体P1-RFLP分型检测方法，其特征在于具体包括如下步骤：

(1)提取待测样本DNA；

(2)首先利用目前已发表的2对外套引物ADH1及ADH2、ADH3及ADH4，样本DNA及其它PCR组份构建PCR反应体系进行扩增，所述2对外套引物的序列分别为ADH1：CTGCCTTGTCCAAGTCCACT；ADH2：AACCTTGTCGGGAAGAGCTG；ADH3：CGAGTTTGCTGCTAACGAGT；ADH4：CTTGACTGATACCTGTGCGG；

其次利用权利要求1所述的8条内套引物、外套引物扩增后的产物DNA及其它PCR组份构建PCR反应体系进行内套引物扩增，其中外套引物物ADH1/ADH2扩增后的DNA，作为内套引物ADH1in/ADH1m和ADH2m/ADH2in的扩增模板，外套引物ADH3/ADH4扩增后的DNA，作为内套引物ADH3in/ADH3m和ADH4m/ADH4in的扩增模板；

(3)对上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，所有阳性产物混合后进行HaeIII酶切来判断型别。

3.根据权利要求2所述的一种肺炎支原体P1-RFLP分型检测方法，其特征在于所述的步骤(2)中的外套引物PCR反应体系为25μl：10×PCR reaction buffer2.5μl，25mM的MgCl₂ 2μl，2.5mM的dNTPs2μl，上游引物10μM1.5μl，下游引物10μM1.5μl，2.5U的Taq DNA polymerase1μl，DNA模板3μl、双蒸水11.5μl。

4.根据权利要求2所述的一种肺炎支原体P1-RFLP分型检测方法，其特征在于所述的步骤(2)中的内套引物PCR反应体系为25μl：10×PCR reaction buffer2.5μl，25mM的MgCl₂ 2μl，2.5mM的dNTPs2μl，上游引物10μM1.0μl，下游引物10μM1.0μl，2.5U的Taq DNA polymerase1μl，外套引物扩增后产物为DNA模板3μl、双蒸水12.5μl。

5.根据权利要求2所述的一种肺炎支原体P1-RFLP分型检测方法，其特征在于所述的步骤(3)中的外套引物PCR扩增条件为预变性94℃ 10min，接着94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 3min，30个循环，最后72℃延伸10min；内套引物PCR扩增条件为预变性94℃ 10min，接着94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 2min，30个循环，最后72℃延伸10min。