[发明专利]一种对安氏军团菌的ITS特异的核苷酸及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种对安氏军团菌(Legionella anisa)中16S rRNA-23S rRNA基因的间区（Internal transcribed spacer, 以下简称ITS）特异的的核苷酸，特别是涉及对安氏军团菌中的ITS特异的寡核苷酸及其应用。

背景技术

经研究发现，安氏军团菌感染的主要途径是经呼吸道感染，含有军团菌的直径小于5 μm的颗粒最适进入肺泡引起感染。人感染军团菌主要是吸入通过气泡喷出和蒸发作用而产生的气溶胶，而气溶胶是军团菌传播、传染的重要载体。军团菌是引起军团病和庞蒂亚克热的主要病原体，前者为严重的呼吸道疾病，潜伏期2-10天，初发症状表现为全身不适、疲乏、头痛、肌肉酸痛、咳嗽、发热、胸痛、呼吸困难、咳血等，还会影响中枢神经系统、消化系统，重症病人会出现肝功能变化及肾功能衰竭，并出现精神紊乱等脏器损害。后者病情较轻，潜伏期1-2天，症状似普通感冒，伴随发热、肌痛、咽喉疼痛、咳嗽等症状，约1-2周可自愈。

目前，对安氏军团菌主要采用常规生物化学检测方法为主，该检测方法容易出现过多的假阳性、假阴性现象，通常需要将待测菌株经较长时间的培养才能进行检测，检测操作过程复杂，检测周期长，通常需要两到三天才能检测完一次待测样品，而且需要较高的技术和设备条件，检测成本高。因而需要发展灵敏度高、快速、简便的检测方法。

近年来，越来越多的分子技术用于病原菌的鉴定、检测及病害诊断中，包括转录间隔区（ITS）序列分析、随机扩增长度多态性（RAPD）分析、核糖体DNA限制性片段长度多态性（RFLP）分析等。和传统检测技术相比，这些基于多聚酶链式反应（PCR）的分子检测技术，不需要经过病原菌的分离、纯培养等过程，而且具有快速、灵敏、特异性强等优点。

核糖体内转录间隔区（ITS）,是介于16S rRNA和23S rRNA之间的区域，在几乎所有细菌的基因组中都以单拷贝或多拷贝的形式存在，相对较短（200bp－1000bp）。该区域进化速率较快，具有超变位点，它的变异速率相当于16S rRNA或者23S rRNA的十倍左右，在种内不同菌株间高度保守，而在细菌的种间存在着丰富的变化。因此具有很高的分辨率，更易区分开进化关系很近的菌种，大大增强了检测的特异性。可以为研究细菌的系统发育、分类鉴定和分子检测提供丰富的遗传信息。

聚合酶链式反应技术（Polymerase chain reaction,简称PCR技术）作为微生物检测的技术目前正在得到认同和推广，该技术相对于传统的方法有高通量、检测速度快、特异性强、灵敏度高等优点，只需对样品进行简单的预增菌或增菌过程，再通过离心及裂解制备细菌DNA模板，就可以在高特异性引物介导下的PCR过程中扩增目标序列，达到检测样品中是否含有待测的致病性微生物的目的。PCR的扩增过程仅需2个小时。这对检验检疫部门和临床检验无疑极大提高了工作速度和降低了工作成本。

发明内容

本发明的一个目的在于提供了一种对安氏军团菌的ITS特异的核苷酸。

本发明的另一个目的在于提供该特异核苷酸的应用，将其设计引物，通过优化和设计，提供一种用于检测安氏军团菌的PCR试剂盒，并利用该PCR试剂盒检测安氏军团菌的存在。

本发明的再一个目的在于提供了对安氏军团菌的ITS特异的核苷酸的分离方法。

本发明的再一个目的在于提供了含有对安氏军团菌的ITS特异的核苷酸的PCR试剂盒的检测方法。

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术方案：

一种对安氏军团菌的ITS有特异性的核苷酸，所述核苷酸包含SEQ ID NO:1所示的序列、SEQ ID NO:2所示的序列；或具有所述核苷酸功能， 上述SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中缺失、替换或插入一个或多个碱基的序列。

所述的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的分离的核苷酸，全长 548和698个碱基。

本发明所述的一种对安氏军团菌的ITS有特异性的核苷酸为源于ITS的寡核苷酸，具有SEQ ID NO:4的序列，是位于SEQ ID NO:1中的267至286的碱基和位于SEQ ID NO:2中的267至286的碱基。

本发明所述的对安氏军团菌的ITS特异的核苷酸的分离方法包括下述步骤：

（1）基因组的提取；

（2）通过PCR扩增安氏军团菌中的ITS基因簇；

（3）构建ITS克隆；

（4）对ITS克隆测序;

（5）核苷酸序列的拼接及分析；