[发明专利]一种对安氏军团菌的ITS特异的核苷酸及其应用

权利要求书

1.一种对安氏军团菌的ITS有特异性的核苷酸，其特征在于所述核苷酸包含如下（1）、（2）或（3）所示的序列：

（1）SEQ ID NO:1所示的序列；

（2）SEQ ID NO:2所示的序列；

（3）具有所述核苷酸功能， 上述（1）或（2）中缺失、替换或插入一个或多个碱基的序列。

2.权利要求1所述核苷酸在制备检测细菌时作为引物用于PCR试剂盒、作为探针用于杂交反应与荧光检测，或用于制造基因芯片或微阵列方面的应用。

3.权利要求2所述核苷酸的应用，其中所述的PCR试剂盒，包括引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，其中的引物指的是：上游引物为SEQ ID NO:3，下游引物为SEQ ID NO:4，上游引物与下游引物的浓度比为1:1。

4.要求权利要求3所述核苷酸的应用，其中上游引物是根据安氏军团菌的含有tRNA-Ala间区的ITS类型设计合成的，所述下游引物是根据细菌的23S rRNA基因保守区设计合成的。

5.权利要求3所述核苷酸的应用，其中所述的PCR试剂盒检测安氏军团菌的检测方法按以下步骤进行：

（1）提取待测样品DNA模板；

（2）在PCR薄壁管中加入dNTP、MgCl₂、10×酶特异性反应缓冲液、Taq聚合酶、引物、待测样品模板和ddH₂O，混匀；

（3）将薄壁PCR中混匀的混合物在PCR仪上扩增；

（4）在电泳设备中电泳扩增产物，记录结果；

（5）分析并进行结果判断。

6.权利要求5所述核苷酸的应用，其中所述步骤（1）中样品模板的提取方法为：

（1）将菌液涂布于BCYE平板置于CO2培养箱中培养，并用ddH₂O刮取菌体；

（2）取500μl的ddH₂O重悬沉淀，在8000rpm条件下离心5分钟，去掉上清液，控干；

（3）取100μl ddH₂O重悬沉淀，在100℃沸水中水浴10分钟；

（4）再置于冰上10分钟后，在12000rpm条件下离心2分钟；

（5）取3μl中层上清做为PCR反应的模板。

7.权利要求5所述核苷酸的应用，其中所述步骤（3）中PCR仪上的反应循环参数包括DNA的变性、复性、延伸的温度和时间、循环次数，具体为：

前期为使变性能够达到所需温度而必需的前期处理过程的一个循环为95℃，5分钟；

变性温度和时间为94℃，30秒；

复性温度和时间为50℃，30秒；

延伸温度和时间为72℃，40秒；

变性、复性、延伸的循环次数为35个循环；

为稳定扩增产物而进行一个循环的温度和时间为72℃，5秒。

8.权利要求5所述核苷酸的应用，其中所述步骤（4）在电泳设备中电泳扩增产物，记录结果的具体步骤为：

（1）取5～10μl扩增产物与6×溴酚蓝上样缓冲液以5：1的体积比混合；

（2）将混合液上样于1％的琼脂糖凝胶上；

（3）将琼脂糖凝胶电泳120v稳压电泳约10分钟，用DL2000 Marker进行对照；

（4）观察并记录结果。