[发明专利]一种大样本快速三维显微成像的方法和系统

说明书

技术领域

本发明涉及显微成像方法及系统，具体地说是指一种适用于大样本的，基于结构光三维层析的显微光学成像方法及系统。

背景技术

在光学显微镜领域，人们一直追求能在更大的成像区域内对获取样本的三维细节信息。但这一目标受到三方面的因素的制约，一是散射光的存在会导致背景光的产生，导致传统显微镜成像除了得到物镜焦面上的信息，还会叠加上来自其它区域的模糊背景，无法获得样本的三维层析图像；二是受限于显微物镜的视场和成像速度，对于厘米级大样本的显微成像通常需要数十天，这不仅是对成像系统稳定性和寿命本身是一个很大的挑战，成像样本也很难在成像环境下长时间保持性状不变；三是标记样本的成像信号强度会由于蛋白的光漂白效应而在整个成像过程中不断下降，成像时间越长，曝光量越大，光漂白对成像的负面影响越大。

美国专利US6376818中描述结构光显微成像作为一种具有获得光学断层成像数据的成像技术，基于面扫探测方式使其具有对样本进行快速成像的潜力。目前的结构光显微镜的大都基于光栅作为光源的调制器，使用压电位移的方式实现对结构照明光的相移，这使得结构光显微镜的成像速度严重受限于光栅机械位移的速度，一般情况只有1赫兹左右。另一类基于数字微镜阵列的结构光显微镜中(例如中国专利，申请号200810071628.5，201110448980.8)，探测器进行曝光期间，数字微镜驱动版通过产生一系列的脉宽调制信号（PWM）控制每个微镜开关状态的占空比，数字微镜时刻在翻转，在不同的两个状态下不停切换，产生256级不同亮度灰度图案。虽然数字微镜阵列中单个微镜的切换速度可达数万赫兹，但这种灰度调制方式将其有效调制速度限制在数十赫兹的水平上。且微型反射镜不断的翻转，使得即使在最亮的灰度级数下，灰度调制的微镜阵列也无法将照明光全部反射至，照明光的利用率较低，降低了结构光照明图案的调制深度，影响了成像速度和成像效果。

综上所述，现存的针对大样本的三维显微成像方法和系统存在以下不足：（1）成像速度慢，对于结构光显微镜，其成像速度主要受限于调制器的有效调制频率；（2）光漂白影响成像质量。这些问题在实际应用中限制了此类方法的发展和应用，因此发展一种适用于大样本的快速三维显微成像方法和系统很有必要。

发明内容

本发明的提供一种大样本快速三维显微成像的方法和系统，目的在于克服现有技术中成像速度慢，对样本光漂白严重，机械加工对样本形态的影响的缺点。

一种大样本快速三维显微成像的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）样本包埋在样本块中，固定在精密三维电动平移台之上；

（2）数字微镜阵列工作在二值调制的模式下，作为结构光显微镜中的空间光调制器，对于照明光进行二值调制，形成结构光条纹，结构光显微镜采集样本表层1－100微米的深度内的图像；

（3）完成成像区域内表层的成像后，利用金刚石或硬质合金刀具，去除样本块表层已成像部分；

（4）重复步骤（2）和步骤（3），直到完成数据获取任务。

所述步骤（2）具体方法为：

（a）数字微镜阵列工作在二值调制的模式下：指当面阵相机进行曝光时，数字微镜阵列中的每个微型反射镜都工作在稳定状态下，不进行任何翻转，出射光在物镜焦面只有亮和暗两种状态，分别对应微型反射镜固定在入射光出射和非出射两种角度的状态，不存在灰度的变化；

（b）当曝光完成后，数字微镜阵列的微镜进行翻转，改变至下一相位图案，同时触发面阵相机进行再次曝光，重复该过程直到完成结构光成像所需的0、2/3pi和4/3pi三幅不同相位图像的采集；

（c）步骤（b）完成后，数字微镜阵列中的微镜统一翻转至入射光非出射的角度上，阻挡照明光照射到样本上；

（d）压电位移器带动物镜进行轴向移动，使物镜焦面对准同一个成像子区域的更深层样本进行成像。

（e）采集得到的图像存储在计算机硬盘或者内存中，利用公式获得层析图像，S表示层析图像，I表示面值相机获取的三幅原始图像，其下标表示三幅原始图像的相位；