[发明专利]从猪脾脏提取超氧化物歧化酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及从猪脾脏中提取超氧化物歧化酶 (Superoxide Dismutase，SOD)的方法，是一种从猪脾脏中制备超氧化物歧化酶的方法。 

背景技术

超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，简称 SOD）别名肝蛋白、奥谷蛋白，是一种广泛存在于各种生物体内的金属酶。SOD 是活性氧清除反应过程中第一个发挥抗氧化作用的酶，能够特异性地清除生物体产生的超氧化物阴离子自由基它能催化超氧自由基 O^2-转变为 H₂O₂和O₂，对体内自由基引起的各种损伤具有清除和保护作用。临床上用于骨性关节炎、类风湿性关节炎、放射与化疗、烧伤、家族性肌萎缩性侧索硬化等方面的治疗。此外在抗辐射、抗肿瘤和预防衰老等多方面研究发现，SOD与多种疾病的预防与治疗有着密切关系。SOD的临床治疗价值正在不断地被人们所认识，已广泛应用于保健品、食品添加剂及化妆品等领域。 

超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, EC1.15.1.1, SOD）自1938年Marn等人首次从牛红血球中分离得到超氧化物歧化酶开始算起，人们对SOD的研究己有七十多年的历史。1969年McCord等重新发现这种蛋白，并且发现了它们的生物活性，弄清了它催化过氧阴离子发生歧化反应的性质，所以正式将其命名为超氧化物歧化酶。自从 McCord 等人首先从牛的红细胞中提取SOD以来，我国学者已经从牛血、猪血、鸭血、猪肝、小白菜、人血红细胞及羊血等物质中纯化出Cu/Zn型SOD。其提取纯化的方法均是在McCord和 Fridovich法的基础上加以改进而来的。文献表明，由动物体中提取纯化的Cu/Zn-SOD，其酶比活明显高于从小白菜叶细胞溶质和叶绿体中纯化的Cu/Zn-SOD。 

目前，SOD生产厂家最常用的提取SOD方法为使用有机溶剂萃取SOD，该方法处理量比较小，生产成本高，而且有机溶剂容易污染环境和极易对生产员工身体造成伤害，无法大规模生产。另外，用动物血液提取SOD，原料的前处理和保存受到很大的限制，不易规模化生产，致使SOD产品价格居高不下。到目前为止，国内外尚无从动物脾脏提取SOD的生产企业，也未见相关报道。为此，我们开发了从动物脾脏提取SOD的工艺方法，本工艺不使用有机溶剂，无加热过程，大大简化了生产工艺，防止了环境污染，而且脾脏原料易得，易于收购保藏，提取的SOD纯度高，收率可达98%以上。 

发明内容

本发明的目的是提供一种成本低廉，高效从猪脾脏提取超氧化物歧化酶的方法。 

本发明的从猪脾脏中提取超氧化物歧化酶的方法，包括以下步骤 ： 

①、屠宰猪立即采取新鲜脾脏，尽量剔除脂肪和结缔组织，进行-20℃冷冻保藏；

②、用切碎机和绞肉机粉碎冷冻猪脾脏，加入5-10倍体积的水，搅拌后，再用骨泥磨磨浆，搅拌浸提过夜(12-24小时)；

③、用卧式离心机，除去颗粒杂质，再用板框过滤机过滤，收集澄清液体；

④、加入30%饱和度的硫酸铵搅拌6小时，板框过滤，收集澄清液体，再补加硫酸铵到60%饱和度，搅拌6小时，板框过滤，收集沉淀。

⑤、沉淀加5-10倍体积的10毫摩尔的Tris-Cl（pH8.0），过滤去除絮状物，收集澄清液体。 

⑥、金属琼脂糖介质用10毫摩尔的Tris-Cl（pH8.0）平衡2个柱体积后，使步骤⑤所得澄清液缓慢通过金属琼脂糖介质柱或与金属琼脂糖介质混合，金属琼脂糖介质再用10毫摩尔的Tris-Cl（pH8.0）加150毫摩尔氯化钠洗涤3-5个介质体积，以便去除杂蛋白。 

⑦、用150毫摩尔柠檬酸钠（pH4.5）洗脱10-20个介质体积，收集洗脱液（洗脱液中含有SOD）；金属琼脂糖介质再用10毫摩尔的Tris-Cl（pH8.0）平衡2个介质体积后，进行下一轮纯化用（可重复使用10次左右，10次以后介质需要再生处理，以恢复介质吸附SOD的能力）。 

⑧、用5摩尔氢氧化钠液调洗脱液pH值到7.5，加入铜盐溶液，至铜离子终浓度为 1-200毫摩尔，用板框过滤机过滤除沉淀，再用3000道尔顿的超滤膜和去离子水清洗SOD脱盐并浓缩到1/50体积，加1摩尔的DTT(二硫苏糖醇，为还原剂)至终浓度0.1摩尔，再用除菌过滤机除菌，冷冻干燥，分装得成品。