[发明专利]从猪脾脏提取超氧化物歧化酶的方法

权利要求书

1.一种从猪脾脏提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于，包括以下步骤 ：

1)、 新鲜冷冻猪脾脏，切碎后加入5-10倍体积的去离子水，搅拌混匀后，磨浆，过滤得含超氧化物歧化酶的澄清液；

2)、 含超氧化物歧化酶的澄清液用30%和60%饱和度的硫酸铵分级沉淀，制备超氧化物歧化酶的粗制品；

3)、 在超氧化物歧化酶粗提品中加入2摩尔pH 8.0的Tris-Cl溶液，至溶液中含10毫摩尔pH8.0的Tris-Cl，再经过铜-IDA琼脂糖介质吸附超氧化物歧化酶，经洗杂、洗脱、脱盐、浓缩、冷冻干燥过程制备高纯度超氧化物歧化酶冻干粉；

上述的脱盐、浓缩步骤如下：先进行超滤膜浓缩从介质上洗脱下来的SOD溶液到1/10的体积；然后加水稀释到原体积，再进行超滤膜浓缩，重复4-5次便达到脱盐的目的；脱盐后的浓缩液加入还原剂DTT，至DTT终浓度为0.01-1mM，不断加水稀释同时继续超滤膜浓缩；上述的超滤膜为截留分子量在1000-10000之间的超滤膜。

2.根据权利要求1所述的一种从猪脾脏提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于，该方

法的具体步骤如下：

①、屠宰猪立即采取新鲜脾脏，尽量剔除脂肪和结缔组织，进行-20℃冷冻保藏；

②、用切碎机和绞肉机粉碎冷冻猪脾脏，加入5-10倍体积的水，搅拌后，再用骨泥磨磨浆，搅拌浸提过夜12-24小时；

③、用卧式离心机，除去颗粒杂质，再用板框过滤机过滤，收集澄清液体；

④、加入30%饱和度的硫酸铵搅拌6小时，板框过滤，收集澄清液体，再补加硫酸铵到60%饱和度，搅拌6小时，板框过滤，收集沉淀；

⑤、沉淀加5-10倍体积的10毫摩尔pH8.0的Tris-Cl，过滤去除絮状物，收集澄清液体；

⑥、金属琼脂糖介质用10毫摩尔pH8.0的Tris-Cl；平衡2个柱体积后，使步骤⑤所得澄清液缓慢通过金属琼脂糖介质柱或与金属琼脂糖介质混合，金属琼脂糖介质再用10毫摩尔pH8.0的Tris-Cl加150毫摩尔氯化钠洗涤3-5个介质体积，以便去除杂蛋白；

⑦、用150毫摩尔pH4.5的柠檬酸钠洗脱10-20个介质体积，收集洗脱液；金属琼脂糖介质再用10毫摩尔pH8.0的Tris-Cl平衡2个介质体积后，进行下一轮纯化用，可重复使用10次左右，10次以后介质需要再生处理，以恢复介质吸附SOD的能力；

⑧、用5摩尔氢氧化钠液调洗脱液pH值到7.5，加入铜盐溶液，至铜离子终浓度为 1-200毫摩尔，用板框过滤机过滤除沉淀，再用3000道尔顿的超滤膜和去离子水清洗SOD脱盐并浓缩到1/50体积，加1摩尔的DTT至终浓度0.1摩尔，所述DTT是还原剂二硫苏糖醇，再用除菌过滤机除菌，冷冻干燥，分装得成品。

3.根据权利要求2所述的一种从猪脾脏提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于，所述吸附SOD用的金属琼脂糖介质是Chelating Genarose FF、IDA琼脂糖介质或NTA Resin，优选IDA介质为吸附剂，所述金属琼脂糖介质是指用二价金属盐溶液与Chelating Genarose FF、IDA琼脂糖介质、NTA Resin混合，使二价金属离子螯合于Chelating Genarose FF、IDA琼脂糖介质、NTA Resin上，再用去离子水清洗介质，除去未结合的多余金属离子，所述金属盐溶液可以是二价铜盐溶液、镍盐溶液、锌盐溶液、锰盐溶液、铁盐溶液或钙盐溶液，包括硫酸铜溶液，氯化铜溶液、硝酸铜溶液、硫酸镍溶液，氯化镍溶液、硝酸镍溶液、硫酸锌溶液，氯化锌溶液、硝酸锌溶液、硫酸锰溶液，氯化锰溶液、硝酸锰溶液、硫酸亚铁溶液，氯化亚铁溶液、硝酸亚铁溶液、硫酸钙溶液，氯化钙溶液或硝酸钙溶液，优选铜离子介质作为吸附SOD的层析介质。