[发明专利]一种剪切DNA的DNA酶

说明书

技术领域

本发明涉及一种催化活性DNA分子，它们能够切割其他DNA序列。

背景技术

已知的自然界存在的几种具有催化活性的RNA。一类已经发现并对其做了四种不同的催化活性修饰，它们被命名为核酶：锤头状(Symons，1992)、发卡(Symons，1992)、肝炎病毒(Wu,Lin et al.1989)和脉孢菌核酶(Saville and Collins 1990)。在自然界，这些核酶可以催化单链翻转、自身剪切等反应。在实验室，这些核酶经过修饰处理(通过在不同的酶和底物中分离具有自身剪切的分子)发挥催化作用，例如：一个酶可以翻转底物(Fauzi，Kawakami et al.1997)，(Guo and Collins1995),(Hegg and Fedor 1995)和(Stage-Zimmermann and Uhlenbeck 1998).另一些核酶通过碱基互补配对识别底物。“锤头”状和“发卡”状的核酶比较特别，经过修饰可以在特定的剪切位点剪切任意的RNA序列，这些核酶已经成功的运用与体内进行灭活目标RNA序列(Reviewed(Lustigand Jeang 2001),(Sun,Cairns et al.2000)，(Muotri，Pereira et al.1999)).

最近能够剪切RNA的DNA酶(DNAenzyme or DNAzymes)已经得到，虽然没有报道过自然界存在DNA酶，但是运用体外筛选(“SELEX”)(Tuerk and Gold 1990)的方法从含有随机序列的文库里分离得到了具有催化功能的DNA酶(Reviewed in(Breaker 1999))，包括能剪切RNA序列的DNA酶。这些DNAzymes在以RNA做为底物的反应中具有多种用途。(Breaker and Joyce 1994)，(Breaker and Joyce 1995)，(Faulhammerand Famulok 1996)，(Faulhammer and Famulok 1997)，(Li,Zheng,etal.2000)，(Roth and Breaker 1998)，(Santoro and Joyce 1997)(Geyer and Sen1997,1998)。上述不同的DNA酶，都可以剪切在通过3'端磷酸二酯键连接单个核糖核苷酸欠在DNA序列中，已经报道的这些反应需要二价金属离子，包括铅离子(Breaker and Joyce 1994),锰离子(Breaker and Joyce1995)，钙离子(Faulhammer and Famulok 1996)和锌离子(Li,Zheng,etal.2000)。还有一种DNA酶是需要组氨酸(Roth and Breaker 1998)。

上述DNA酶只能特异性的剪切中间含有一个核糖核苷酸的DNA序列不能剪切全DNA序列的底物.Breaker筛选的能发生自身剪切的DNA酶(Breaker，1996)和Silverman筛选出的依赖锌离子和锰离子的10MD5(Silverman and Sachdeva 2009)是仅有的两例剪切DNA的DNA酶。

发明内容

本发明描述了一种具有位点特异性内切核酸酶活性的DNA酶，这种活性针对预先选定的底物核酸序列中被定义为切割位点的脱氧核苷酸序列具有特异性。

该DNA酶具有第一和第二两个底物结合区域,位于核心区域的两侧，其中所述的第一底物结合区域有一段序列与预先选定的底物核酸序列的第一部分互补，而所述第二底物结合区域有一段序列与预先选定的底物核酸序列的第二部分互补，核心区域有一段选自下列通式所述序列的其中之一的序列：

(I.)CACTGT(SEQ ID NO10),TGT茎，TC环，TATTCCTGGATAA(SEQ ID NO9)，其中TGT茎部分通过碱基互补配对，TGT茎可以延长一个碱基对，并且TGT茎上的碱基对可以替换只要符合碱基互补配对原则。SEQ ID NO 9中有五个突变位点之内的突变或缺失,SEQ ID NO 10有三个突变位点之内的突变或缺失；TGT茎，TC环部分有60个碱基以内的插入或缺失属于本发明的保护范围。在一个优选实施例中,式I为SEQ ID NO 6(A-2)。