[发明专利]一种草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于鱼类病毒检测技术领域，具体涉及一种草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒，还涉及一种利用草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒检测草鱼呼肠孤病毒的方法。

背景技术

草鱼出血病是传染性、致病性都很强的一种严重病毒性疾病，主要危害草鱼鱼种。1972年首次在湖北滠口发现，并命名为草鱼出血病。1978年首次通过电镜观察证实该病原为病毒。1983年首次分离出爆发性草鱼出血病病原，并根据其形态学、理化特性等研究鉴定该病毒为呼肠孤病毒。1991年国际病毒分类委员会第五次会议将该病毒正式命名为草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV),并纳入呼肠孤病毒科(Reoviridae)水生呼肠孤病毒属(Aquareovirus)。草鱼呼肠孤病毒是我国分离鉴定的第一株鱼类病毒，现在已有资料证实该病毒是水生呼肠孤病毒属中致病力最强的毒株，目前国内已报道了20多个分离株。

对草鱼呼肠孤病毒的检测的方法很多，电镜观察是最直接的方法，细胞培养分离病毒、空斑试验、病毒核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)等经典方法较为复杂，目前国内外检测草鱼呼肠孤病毒最常用的还是免疫学检测方法及RT-PCR方法等。免疫学方法在敏感性和特异性上有待提高，并且存在空窗期、交叉反应、血清型差异等问题。在现有的关于RT-PCR检测GCRV的公开文献中，都是采用传统的两步法RT-PCR技术，即将反转录和PCR反应分管分步进行。RT-PCR检测病原在近年来越来越趋向于采用一步法进行反应。与两步法相比，简化了操作程序、降低了样品交叉污染的可能性，对反应的干扰因素少，能获得良好的重现性，又降低了成本，为开发同时检测多种病原的多重RT-PCR创造了有利条件。

发明内容

本发明的一个目的是在于提供了一种草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒，通过分析比对GenBank中已有的草鱼呼肠孤病毒基因序列（AF260512、AF284502、GQ896335、HQ231199、JN967630），针对病毒核酸第2片段序列设计并筛选了一对兼并引物，从而实现一步法检测GCRV病毒的目的，所用的试剂均为国产试剂，大大降低了实验成本，从分子水平对草鱼呼肠孤病毒进行快速检测，具有简便、快速、高特异性和灵敏性的特点。

本发明的另一个目的是在于提供了一种利用草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒检测草鱼呼肠孤病毒的方法，本方法可在3小时内准确检测出样品中的GCRV，能检测GCRV感染的草鱼组织，也能检测GCRV感染的细胞（例如CIK细胞），非常适用于GCRV的快速检测。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒，包括以下成分：

该试剂盒包括以下成分：5×AMV buffer，Taq酶10×PCR buffer(Mg²⁺free)，MgCl₂，dNTPs，引物GCRVF和GCRVR，AMV酶，Taq酶。

GCRVF:5’-GGBTCCACDGYMACVTCCAC-3’；

GCRVR:5’-WDRTCRCCKKGRGGCATGTA-3’。

一种利用草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒检测草鱼呼肠孤病毒的方法，其步骤是：

1、病毒RNA的获取：

采用或LS试剂或柱吸附洗脱法等提取样本总RNA。

2、RT-PCR扩增：

采用25μl反应体系：在PCR管中加入预处理的核酸模板5μL，5×AMV buffer1μL，Taq酶10×PCR buffer(Mg²⁺free)2μL，MgCl₂(25mM)0.5-3μL，dNTPs(25mM)0.5μL，引物(20μM)各0.5μL，AMV酶0.5μL，Taq酶0.5μL，补加灭菌水至25μL。放入PCR仪进行RT-PCR反应，先45℃30min，95℃3min，再按95℃20s-52℃20s-72℃40s作35个循环，最后72℃延伸5min，4℃下保温。同时设置阳性对照和阴性空白对照。

3、检测结果判定：

取扩增产物，用1.5%（w/v,以下相同）的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示在650bp大小处有条带，则结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。

一种利用草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒检测草鱼呼肠孤病毒的方法（最佳条件），其步骤是：

1、病毒RNA的获取: