[发明专利]一种草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种草鱼呼肠孤病毒 RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，包括以下成分： 

5×AMV 缓冲液，无镁Taq酶10×PCR 缓冲液，MgCl₂ ，dNTPs ，引物GCRVF和GCRVR，AMV酶，Taq酶；

GCRVF: 5’-GGBTCCACDGYMACVTCCAC-3’；

GCRVR: 5’-WDRTCRCCKKGRGGCATGTA-3’。

2.利用权利要求1所述的一种草鱼呼肠孤病毒 RT-PCR检测试剂盒检测草鱼呼肠孤病毒的方法，其步骤是：

1）、病毒RNA的获取:

采用TRIzol^?或TRIzol?LS试剂或柱吸附洗脱法提取样本总RNA；

2）、RT-PCR扩增:

采用25μl反应体系：在PCR管中加入步骤1）中提取的样本总RNA 5μL，5×AMV 缓冲液 1μL，无镁Taq酶10×PCR 缓冲液 2μL，25mM MgCl₂ 1μL，25mM dNTPs 0.5μL，20μM 引物 各0.5μL，AMV酶 0.5 μL，Taq酶0.5 μL，补加灭菌水至25μL，放入PCR仪进行RT-PCR反应，先45℃30 min，95℃3min，再按95℃20s-52℃20s-72℃40s做35个循环，最后72℃延伸5min，4℃下保温，同时设置阳性对照和阴性空白对照；

3）、检测结果判定，采用下述方式：

取扩增产物，用1.5% w/v 的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示在650bp大小处有条带，则结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。