[发明专利]甘蔗黄锈病菌PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种甘蔗病原菌的检测方法，具体涉及甘蔗黄锈病菌PCR检测方法，属于生物技术领域。

背景技术

甘蔗黄锈病（Sugarcane orange rust disease）属真菌性病害，由属于屈恩柄锈菌的甘蔗黄锈病菌（Puccinia kuehnii）引起。病原菌可经由风快速传播，然后通过气孔侵入，造成感病品种蔗茎产量和蔗糖分的损失。与甘蔗褐锈病不同，甘蔗黄锈病在春季更流行，适宜的环境条件更利于病害发展，例如温暖湿润的夏季和凉爽的秋季。

甘蔗黄锈病主要危害甘蔗叶片，在叶片上产生淡黄色小斑点，后病斑在叶片正背两面产生长2～10 ram的橙黄色夏孢子堆，因此称为黄锈病。危害症状最初较轻，病斑不明显，随病斑扩大，拉长的黄色病斑留下浅黄绿色晕圈，且颜色由桔色发展到橙棕色。与一般的褐锈病不同，桔色锈斑从来不会发展为暗褐色。锈病脓包在叶表成团发生，且大多发生在低层叶片表面，病斑多在叶片基部。控制甘蔗黄锈病发生的首要措施为培育和栽种抗黄锈病甘蔗品种，在此过程中，如何检测目标甘蔗品种中是否含有甘蔗黄锈病菌以及检测的的效率和准确性与甘蔗抗黄锈病育种的进程和效果密切相关。目前，一般采取两种方法判断种茎是否带菌：一种是采用分离培养技术，在建立纯培养物的基础上，根据培养物所产生孢子的形态特征进行鉴定，屈恩柄锈菌夏孢堆叶背生，长0.5～1 mm，表皮破裂时散出肉桂色粉状物。夏孢子卵圆形，表面具刺，浅黄色，大小25～42×17～25 (μm)，壁厚1.5～2.5 μm，赤道上有4个芽孔。冬孢子堆黑色，冬孢子长椭圆形，顶端圆或平，深褐色，大小30～56×15～22 (μm)，壁厚2～4.5 μm，具一隔膜，柄短，黄褐色；另一种是基于该病害表型症状，因为甘蔗受黄锈病菌侵染后，病害症状表现为黄色病斑，拉长的病斑留下浅黄绿色晕圈，且颜色由桔色发展到橙棕色，且桔色锈斑从来不会发展为暗褐色，因此，可以采用种茎种植后，观察是否发生甘蔗黄锈病判断待检测甘蔗品种是否含有黄锈病菌。但是，上述的第一种方法由于分离培养以及最终建立纯培养物需要时间长，加上分离过程杂菌污染等，都会影响分离效果，检出效率不高；第二种方法则由于甘蔗、环境条件和病原菌三者之间的互作，可能导致即使种茎中存在该病原，病害也不一定会发生的现象，只有三个因素都具备，病害才能发生，因此，田间基于诱发的抗病性鉴定方法，鉴定结果难以预料，而且还存在不同地点、不同年份间的鉴定结果有较大的差异以及耗时长达几个月等逆势。显然，目前已有的技术方法，对于判断种茎是否带菌是不适用的，急需建立一种能够实现“快速”与“准确”目标要求的甘蔗黄锈病菌的检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种甘蔗黄锈病菌PCR检测方法，可用于田间甘蔗黄锈病菌的早期诊断及检测。

    本发明的甘蔗黄锈病菌PCR检测方法，包括基因组DNA的提取、PCR检测体系建立和PCR扩增产物的检测，其特征在于： 

1、PCR检测体系的建立：PCR扩增体系为总体积25 μl，内含2.5 μl 10×PCR缓冲液，2.5 μl 25 mmol/L MgCl₂，0.5 μl 10 mmol/L dNTP，10 μmol/L 的检测引物PCR-F和PCR-R各1.0 μl，1.25 U Taq DNA Polymerase，20-30 ng基因组DNA，ddH₂O补足到25 μl； PCR扩增程序如下：94 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃8 min；所述10×PCR缓冲液组成成分为100 mmol/L pH8.5 Tris-HCl，500 mmol/L KCl和15 mmol/L MgCl₂；

    所述检测引物如下：     

PCR-F：5'-CACATCAAGGAAGGTGTTACCT-3′，

PCR-R：5'-GAGCCACAATTAAGTGCACTCT-3'；

2、PCR扩增产物的检测：琼脂糖凝胶电泳检测的PCR扩增图谱中，在分子量为525 bp的位置出现DNA条带，为甘蔗黄锈病菌存在的标志。

本发明的应用效果：

本发明的甘蔗黄锈病菌PCR检测方法，具有灵敏度高，所需要的DNA用量少的特点；与常规的根据病菌培养后的孢子形态特征鉴定或根据田间种植后病害表型症状鉴定的方法相比，具有实用性好、准确性高和操作简便快速等优点。