[发明专利]一种抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌复合特异性IgY抗体及其制备方法和牙膏

权利要求书

1.抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌复合特异性IgY制剂，其特征在于，由10～70重量份的牙龈卟啉单胞菌菌体和菌体碎片与30～90重量份的具核梭杆菌菌体和菌体碎片复合成抗原免疫产蛋母鸡而制备。

2.权利要求1所述的抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌复合特异性IgY制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

A．牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌培养步骤

A.1细菌种类：牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）和具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）；

A.2取牙龈卟啉单胞菌（P.g）ATCC33277菌株和具核梭杆菌（Fn）ATCC10953菌株，分别经BHI-S培养基分离培养和扩增培养的牙龈卟啉单细胞菌、具核梭杆菌，并经鉴定确认为牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌而得到牙龈卟啉单胞菌菌体和菌体碎片、具核梭杆菌菌体和菌体碎片；

B．免疫原制备步骤：

B.1取牙龈卟啉单胞菌菌体和菌体碎片10～70重量份，具核梭杆菌菌体和菌体碎片30～90重量份复合成菌液抗原；

B.2将等体积的菌液抗原与等体积的福氏完全佐剂复合，使用高速搅拌器搅拌乳化，最终制成油包水福氏完全佐剂牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌复合免疫原；每毫升福氏完全佐剂复合免疫原含有细菌10亿-80亿；

B.3将等体积的复合菌液与等体积的福氏不完全佐剂复合，使用高速搅拌器搅拌乳化，最终制成油包水福氏不完全佐剂牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌复合免疫原，每毫升福氏不完全佐剂复合免疫原中含有细菌10亿-80亿；

C．免疫步骤：

使用注射器将福氏完全佐剂复合免疫原皮下和肌肉注射给产蛋母鸡，每只产蛋母鸡注射0.5ml-3.0ml免疫原，然后每隔一周使用福氏不完全佐剂复合免疫原0.5ml-3.0ml皮下和肌肉注射给产蛋母鸡。加强免疫二次后，此后每隔十周再使用福氏不完全佐剂复合免疫原0.5ml-3.0ml皮下和肌肉注射给产蛋母鸡加强免疫五次，前后共免疫八次；

D．抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌复合特异性IgY提取物的制备：

收集免疫第一次免疫后第28天的免疫母鸡鸡蛋，使用75%的酒精进行鸡蛋表面消毒，打开蛋壳取蛋黄，去除蛋黄膜取蛋黄液，将蛋黄液与蒸馏水按体积比1:10的比例加蒸馏水，充分搅拌，并使用冰醋酸调节酸碱度至pH5.30-5.50，然后放置-20℃冻藏3天后取出解冻，取上清液，用凝胶过滤系统将蛋黄液浓缩20倍，用1N NaOH调节PH至7.0-8.0，置-20℃保藏。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤D后增加一IgY纯化步骤，具体是将抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌复合特异性IgY提取物加硫酸胺至55%的饱和度，充分搅拌，室温静置2小时，然后高速离心10分钟，取沉淀，将沉淀使用蒸馏水稀释到原体积量，再加硫酸胺至33%的饱和度，充分搅拌，室温静置2小时，然后高速离心10分钟，取沉淀，用蒸馏水稀释溶解后装入透析袋，用蒸馏水经中空纤维过滤器除盐，即得抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌复合特异性IgY制剂纯品。

4.如权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤D用以下方法所取代：收集免疫第一次免疫后第28天的免疫母鸡鸡蛋，用75%酒精消毒鸡蛋外壳，打碎蛋壳，留取蛋黄。用去离子水10倍稀释蛋黄后，用冰醋酸和无水乙酸钠调节PH至5.30-5.50.，4℃沉降后取上清液，添加2%的壳聚糖和海藻酸钠，2%氯化钙和多聚磷酸钠絮凝沉降，再取上清液用凝胶过滤系统超滤去除多余的去离子水，将蛋黄液浓缩20倍左右，用1N氢氧化钠调节PH至7.0-8.0，置-20℃保藏。

5.用权利要求1所述的抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌复合特异性IgY制剂制备的牙膏，其特征在于，包含有抗牙周致病菌IgY制剂，所述抗牙周致病菌IgY制剂由占牙膏总质量的质量百分比原料组成：

抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌复合特异性IgY制剂0.01～0.5%、洗必泰0.01-2.0%、甘油1.0-30.0%、聚乙烯吡咯烷酮0.1-2.0%，其中洗必泰、甘油、聚乙烯吡咯烷酮构成抗牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌复合特异性IgY制剂保护剂。

6.如权利要求5所述的牙膏，其特征在于，还包含牙膏膏剂，所述牙膏膏剂由占牙膏总质量的质量百分比原料组成：卡波浦尔0.1～0.5%、羧甲基纤维素钠0.5～1.3%、卡拉胶0.2～0.5%，黄原胶0.3～0.7%，甘油5.0～20.0%，山梨醇5.0～70.0%，阿斯巴甜0.1～0.5%；糖精钠0.1～0.3%，PEG-6000.5～5.0%，PEG-12000.5～5.0%，椰油酰胺丙基甜菜碱0.1-2.0%，香精0.8～2.0%，SiO₂1.0～30%，去离子水余量。