[发明专利]具有宽广pH活性纤维素酶及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及到生物遗传领域，具体涉及一种来源于深海真菌Phaeosphaeria sp.LH21的具有宽广pH活性纤维素酶及其制备方法。

背景技术

纤维素酶是一种由三种不同酶构成的复杂体系，具体分为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶及β-葡聚糖苷酶。微生物是纤维素酶的主要来源。真菌纤维素酶一般在酸性pH条件下具有生物活性，可应用于饲料行业、生物乙醇的生产等，但也有例外，一些真菌纤维素酶也可以在中碱性pH条件下具有纤维素酶活性，例如来源于特异腐质霉、热白丝菌的纤维素酶，具有生物石洗功能，达到起花作用，立体感强。由于中碱性纤维素酶受到越来越多的关注，一些研究者集中于细菌纤维素酶的研究，比如，芽孢杆菌、链霉菌的一些纤维素酶最适pH为中碱性，能耐受较高的pH，其中芽孢杆菌碱性纤维素酶已经应用于洗涤剂行业，可以除去织物表面的纤维绒毛，让织物看起来艳丽，起到除旧返新的效果。

有很多纤维素酶的基因被克隆了，由于细菌基因组中不含有内含子，能够快捷分离其纤维素酶基因，而相对于真菌纤维素酶的基因来说，要快速分离到其纤维素酶基因，难度相对来说更大，相关的专利也就较少，报道最多的是里氏木霉纤维素酶，它能协同水解纤维素，其效率较高，其中一些纤维素酶的表达已经在里氏木霉得到加强，如内切纤维素酶。在这里，我们通过现代生物信息学技术，得到一种新颖的具有宽广pH活性纤维素酶的基因编码区DNA及其多肽。虽然现有背景技术中存在涉及到上述的一些或者所有性质的纤维素酶，但是还是要需要具有新的广谱pH的纤维素酶，而此纤维素酶在生物石洗、织物抛光、纸桨处理以及生物质的转变是很有用的。

发明内容

本发明的目的就是为了解决上述现有技术存在的问题，提供一种具有宽广pH活性纤维素酶及其制备方法。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：一种具有宽广pH活性纤维素酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述具有宽广pH活性纤维素酶基因，其中，所述的纤维素酶基因编码的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述纤维素酶基因的编码多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述编码多肽，其中，所述的编码多肽在pH6-10条件下具有75％以上的纤维素酶相对活性，并且能在pH3-10保存下具有90％以上的残余相对活性。

一种具有宽广pH活性纤维素酶的制备方法，包括以下步骤：

1)由深海真菌Phaeosphaeria sp.LH21培养分离出具有宽广pH活性纤维素酶基因，该基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

2)将基因克隆到表达载体pPIC9K中；

3)将构建的表达载体转入到宿主细胞，生产具有宽广pH活性纤维素酶的基因工程菌；

4)培养基因工程菌，获得具有宽广pH活性纤维素酶。

上述具有宽广pH活性纤维素酶的制备方法，其中，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞，原核细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌、或分支杆菌；真核细胞包括酵母细胞、里氏木霉、黑曲霉、米曲霉或各种动植物细胞。

本发明以来源于深海真菌Phaeosphaeria sp.LH21的基因组为基础，利用同源性搜索得到保守性氨基酸片段，设计简并性引物得到中间序列，用基因组走读扩增两端未知序列，反转录PCR扩增该基因，然后克隆到表达载体pPIC9K中，并在毕赤酵母GS115中获得表达。通过Genbank同源搜索和蛋白质功能鉴定研究表明，该基因的编码区DNA是一个编码纤维素酶的DNA序列。该基因能在任何宿主细胞中表达，表达的纤维素酶在pH6-10条件下具有75％以上的纤维素酶相对活性，此纤维素酶还能在pH3-10条件下能保持残余相对纤维酶活性90％以上。

另外，本发明还提供了在宽广pH条件下具有最佳纤维素酶活性的多肽的氨基酸序列及功能等同突变体。

在本发明中，编码的纤维素酶在pH6-10条件下可以表现出75％以上的相对活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1的核苷酸序列及其简并密码子所产生的序列。由已知密码子的简并性，与SEQ ID NO.1核苷酸序列同源性小于70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列，还包括核苷酸杂交的核苷酸序列。还可包括同源性至少70％的核苷酸序列。