[发明专利]奶山羊乳房炎病原菌多重PCR检测试剂盒的制备方法

说明书

一、技术领域：

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种奶山羊乳房炎病原菌多重PCR检测试剂盒的制备方法。

二、背景技术：

羊奶及其奶制品有着优良的营养价值和巨大的经济效益，而在羊奶的重要来源奶山羊养殖业中，乳房炎是一种广泛流行的传染性疾病，降低原奶产量及其质量，甚至带来严重的经济损失。引起乳房炎的重要原因是致病菌感染乳房，主要的乳房炎致病菌有金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）、乳房链球菌（Streptococcus uberis，S. uberis）、停乳链球菌（Streptococcus dysgalactiae，S. dysgalactiae）、无乳链球菌（Streptococcus agalactiae，S. agalactiae）、克雷伯氏菌（Klebsiella pneumonia, K. pneumonia）。对乳房炎致病菌的检测、鉴定，不仅是判断产奶母畜是否患有乳房炎的重要依据，而且为临床预防、治疗乳房炎提供有效的信息。传统的致病菌检测以细菌分离、生化鉴定实验为基础，假阴性率高且耗时。

三、发明内容：

本发明的目的在于提供一种奶山羊乳房炎病原菌多重PCR检测试剂盒的制备方法，对提高乳房炎的检测、监控水平，保障羊奶及其奶制品食品安全具有重要意义。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为 ：一种奶山羊乳房炎病原菌多

重PCR检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述的制备方法为：

1）待检样本DNA提取；

2）设置PCR检测试剂盒：由PCR试剂管、阳性对照、阴性对照、Taq DNA聚合酶、溴酚蓝上样缓冲液（常规使用浓度）组成；

3）PCR扩增：在PCR检测管中加入预处理的DNA样本及Taq DNA聚合酶，同时设置阳性、阴性对照，微量移液器吹打混匀后瞬间高速离心，PCR仪进行扩增反应；

    4）PCR扩增产物分析：将上述PCR扩增产物进行凝胶电泳，与阳性、阴性对照比较待检样本所出现的电泳条带，以判断待检样品是否为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、乳房链球菌、停乳链球菌、无乳链球菌、克雷伯氏菌的单一或混合感染。

所述的步骤3）中的PCR进行扩增反应的反应循环条件为：95 ℃预变性4 min，94 ℃变性1 min，60.5 ℃退火90 sec，72 ℃延伸1 min，30个循环后72 ℃延伸8 min，保存PCR产物于4 ℃待检。

所述的多重PCR检测试剂盒是以原有的PCR检测技术为基础，将多个单一PCR置于同一反应体系、同一反应条件中进行，同时达到对多种致病菌的检测。

与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：

1、一种对奶山羊金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、乳房链球菌、停乳链球菌、无乳链球菌、克雷伯氏菌单一或混合感染乳房，引起乳房炎的多重PCR检测方法，可快速、高效、准确的检测出待检个体是否为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、乳房链球菌、停乳链球菌、无乳链球菌、克雷伯氏菌致病菌的单一或混合感染，此外本试剂盒也可用于奶山羊感染金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、乳房链球菌、停乳链球菌、无乳链球菌、克雷伯氏菌的分子流行病学调查及疗效监测。本方法以分子生物学知识为基础，避免了传统检测方法镜检时的细菌、杂质颗粒干扰，从而大大提高了诊断准确率。

2、本发明建立6种乳房炎主要致病菌的多重PCR快速检测试剂盒，可同时达到对多种致病菌的检测，是一种省时、高效的检测方法，可为临床、亚临床乳房炎的治疗提供科学依据，而且对提高乳房炎的检测、监控水平，保障羊奶及其奶制品食品安全具有重要意义。

四、附图说明

图1为各个菌种的单重PCR检测结果图（M： 100 bp DNA ladder; 1：大肠杆菌; 2: 停乳链球菌; 3: 金黄色葡萄球菌; 4: 无乳链球菌; 5: 乳房链球菌; 6: 克雷伯氏菌; 7: 阴性对照）；

图2为多重PCR凝胶电泳结果图。

五、具体实施方式

本发明多重PCR检测，是以原有的PCR检测技术为基础，将多个单一PCR置于同一反应体系、同一反应条件中进行，可同时达到对多种致病菌的检测，