[发明专利]一种红曲色素高产菌株的高通量筛选方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物学领域，涉及一种用于微生物诱变育种、发酵工程领域以实现对菌种高通量筛选的方法，尤其涉及一种高耗氧的产色素真菌的高通量筛选方法。

背景技术

红曲古代称丹曲，起源于中国，是红曲霉属菌株(Monascus purpureus)在生长代谢过程中产生的天然色素，也是世界上目前仅有的利用微生物生产的食用天然色素。在中国已有1000多年的生产和应用历史，长期以来广泛用作食品着色剂和调味剂等。目前主要通过传统的固态发酵产品红曲米提取物和深层液态发酵红曲菌提取物红曲红来获得。相对合成色素和其它已知天然色素而言，它具有安全性高、热稳定性强、对蛋白质的染着力好、色调鲜艳、质量稳定和价格低廉等优点。近年来，科研人员不断的深入研究发现红曲霉可以产生多种功能性活性物质，有抑菌防腐、降低血脂和预防心血管疾病等特殊的生理功能，随着市场需求量正日益扩大，优良的红曲霉菌株是发酵生产红曲色素的关键。

从当前中国生物技术产业来看，目前高产的工业生产菌种的获得主要还是采用随机选育，包括自然选育、诱变育种和以原生质体融合为代表的杂交育种技术，筛选工作量大，费时费力。这是因为产量性状受多基因决定，一次诱变和筛选很难有大幅度提高，需要多轮诱变筛选才能获得稳定、高产的单菌落培养物(菌株)，每轮都是一个大量筛选的过程，这一点不同于以发现化合物为目标的菌种筛选。因此，扩大筛选量可以有效减少随机筛选的盲目性特点，是提高育种效率的一个重要方面，可以说筛选是菌种选育过程成败的一个关键步骤，但无论是随机筛选还是推理选育，都受到人力物力等诸多因素的限制，使得筛选效率很低，势必造成漏筛。因此，需要建立新的筛选方法以提高筛选效率。

近几年用于微生物菌种高通量筛选装置及其相关技术不断发展和成熟。特别是欧美等发达国家开发出全自动高通量筛选工作站，应用最先进的计算机技术和机器人技术，能够实现高效高通量筛选，但是此类大型设备价格相当昂贵，即使在发达国家，也只有财力雄厚的大型实验室具备购买能力。因此，使用现有的通用低成本仪器设备，自主开发简便、快速、精准、高效的高通量筛选技术具有重要现实意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种红曲色素高产菌株的高通量筛选方法。

在本发明的第一方面，提供一种高通量筛选红曲色素高产菌株的方法，包括：

(1)以红曲霉菌为出发菌株，进行诱变处理，获得经诱变处理的菌丝悬液混合体；

(2)将经诱变处理的菌丝悬液混合体，等量等分后分别加入到装有发酵培养基的深孔板的各孔中进行培养，获得培养液；同时设置对照孔，其中加入等量出发菌株的菌丝悬液；和

(3)测定在530nm波长下各孔中培养液的吸光度，获得培养液的色价；比较各孔中培养液的色价，追踪出色价高于出发菌株的菌丝悬液混合体(其中含有混合菌群)，从中分离获取高产菌株单菌落。

在另一优选例中，步骤(1)中，采用紫外线照射诱变方法进行诱变处理。

在另一优选例中，所述紫外线照射诱变方法包括：将菌丝悬液置于直径带搅拌子的平皿中，开启磁力搅拌器，距离15W紫外灯20cm处，照射3分钟，然后加入等量体积的1.0%氯化锂溶液(10ml)，混匀静置20分钟。

在另一优选例中，步骤(2)中，所述的深孔板选自(但不限于)：12孔板、24孔板、48孔板、96孔板、192孔板或384孔板。

在另一优选例中，步骤(2)中，所述的深孔板是24孔板；更佳地是方底24深孔板；和/或

采用酶标仪测定在530nm波长下各孔中培养液的吸光度；

每孔装发酵培养基50-70μl。较佳地，种子培养基和发酵培养基是装在24深孔板中，色价检测是在96孔酶标板中。培养时候培养基装量在1.2ml，检测时酶标板每孔最大装300μl。

在另一优选例中，所述的酶标仪与所述深孔板是对应的，所述的酶标仪适合于检测所述的深孔板中各孔的吸光度。

在另一优选例中，步骤(2)中，培养条件是：220±50rpm、33±2℃培养40-50小时；

在另一优选例中，先在一深孔板的孔中进行种子培养：220±50rpm、33±2℃培养40-45小时；之后转移到另一深孔板相应的孔中进行发酵培养：220±50rpm、33±2℃培养45-50小时。