[发明专利]甘蔗赤条病菌巢式PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物病菌PCR检测方法，具体涉及甘蔗赤条病菌（Acidovorax avenae subsp. avenae）巢式PCR检测方法，属生物技术领域。 

背景技术

甘蔗赤条病属于甘蔗细菌性病害，病菌为Acidovorax avenae subsp. avenae,1890年首次报道在夏威夷发生，1923年澳大利亚的局部地区发生此病，造成严重损失。该病是一种在全世界甘蔗种植区域频繁爆发的一种毁灭性甘蔗病害，病害有叶条斑和顶腐两种类型。两者可以单独发生，亦可并发。叶条斑型：一般多发生于嫩叶叶片中部，靠近中脉部位。最初表现为水渍状绿条，绿条两端迅速扩展成长条状红色至红褐色病斑。顶腐型：表现为老叶黄化、枯萎、其早期症状是甘蔗生长点附近的维管束变红、腐烂，进一步发展，导致节间大腔穴的形成，后期心叶腐烂，可以从外面包着的叶鞘中拉出来，并具有一种特殊的难闻臭味。甘蔗赤条病菌在田间主要靠风、雨传播。在潮湿温暖的条件下容易发病，而且病叶的伤痕表面常有细菌溢泌物，借助雨水和气流传播。患病的枯老蔗叶、病茎中的病原菌经4个月后仍然有致病力。因此建立甘蔗赤条病菌的快速、准确、灵敏的检测技术，对该病的防治起到十分关键的作用，同时，也为甘蔗赤条病抗病鉴定和甘蔗引种检疫提供技术参考。 

常用的检测病菌的方法有生物学鉴定法、电镜技术、酶联免疫技术和分子生物学技术等。生物学鉴定法耗时、且步骤繁琐；电镜技术需要植物组织切片，步骤繁琐，且只能通过形态学观察判断；酶联免疫技术需要特异性的抗血清，且灵敏度不及分子检测技术；基于PCR原理的分子生物学技术是一种灵敏度高、特异性强的快速检测技术，在其它甘蔗病原物的检测已得到广泛应用。目前甘蔗赤条病菌的PCR检测方法未见报到。在细菌基因组中, 编码16S rRNA 的 rDNA 基因具有良好的进化保守性,目前16S rDNA的序列信息已经广泛应用于菌种分子鉴定和系统发生学研究。 

发明内容

本发明的目的是提供一种甘蔗赤条病菌巢式PCR检测方法，以克服现有技术中的不足之处。 

本发明的目的是通过以下方法实现的。 

    本发明的一种甘蔗赤条病菌巢式PCR检测方法，包括甘蔗叶片DNA提取、引物设计、第1轮PCR扩增、第2轮PCR扩增和电泳检测；其特征在于： 

（1）引物设计：扩增甘蔗赤条病菌的引物SRSD-16S-F1和SRSD-R2、SRSD-F1和SRSD-R1的序列如下：

  SRSD-16S-F1：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’

  SRSD-R2：5’-TGTCAAAGGTGGGTAAGGTT-3’；

SRSD-F1：5’-ACGGTAACAGGTCTTCGGA-3’

SRSD-R1：5’-CAGTTGACATCGTTTAGGGC-3’；

    （2）第1轮PCR扩增：PCR扩增体系为总体积50 μL，内含5.0 μL 10×PCR 缓冲液，4.0 μL 2.5 mmol/L dNTPs，10 μmol/L引物SRSD-16S-F1和SRSD-R2各2.0 μL，0.25 U Taq DNA Polymerase，500 ng甘蔗叶片基因组DNA，ddH₂O补足到50 μL； PCR扩增程序如下：94 ℃预变性3 min、94 ℃变性45 S、55~60 ℃退火30 S、72 ℃延伸60 S，共30~35个循环，最后72 ℃再延伸7 min；所述10×PCR缓冲液组成成分为500 mmol/L KCl，100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.3)，15 mmol/L MgCl₂；

    （3）第2轮PCR扩增： PCR扩增体系为总体积50 μL，内含5.0 μL 10×PCR 缓冲液，4.0 μL 2.5 mmol/L dNTPs，10 μmol/L引物SRSD-F1和SRSD-R1各2.0 μL，0.25 U Taq DNA Polymerase，第一轮PCR产物稀释100倍后取1.0 μL，ddH₂O补足到50 μL；PCR扩增程序如下：94 ℃预变性3 min、94 ℃变性45 S、53~57 ℃退火30 S、72 ℃延伸45 S，共30~35个循环，最后72 ℃再延伸7 min；

    （4）电泳检测：出现一条分子量为755 bp的核酸带的样品，为感染甘蔗赤条病菌的植株叶片样品。